חיים בטמפרטורות גבוהות שנצפו במבחנה עם ננו-חלקיקי זהב מחוממים בלייזר

תודה שביקרת ב-Nature.com. לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת. לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
תרמופילים הם מיקרואורגניזמים המשגשגים בטמפרטורות גבוהות. לימודם יכול לספק מידע רב ערך על איך החיים מסתגלים לתנאים קיצוניים. עם זאת, קשה להשיג תנאי טמפרטורה גבוהים עם מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. הוצעו מספר פתרונות תוצרת בית המבוססים על חימום חשמלי התנגדות מקומי, אך אין פתרון מסחרי פשוט. במאמר זה, אנו מציגים את הרעיון של חימום לייזר בקנה מידה מיקרוסקופי על פני שדה הראייה של המיקרוסקופ כדי לספק טמפרטורות גבוהות עבור מחקרים תרמופילים תוך שמירה על הסביבה של המשתמש מתונה. ניתן להשיג חימום בקנה מידה מיקרו בעוצמת לייזר מתונה באמצעות מצע מצופה ננו-חלקיקי זהב כבולם אור תואם ביולוגי ויעיל. נדונות השפעות אפשריות של הסעת נוזלים בקנה מידה מיקרו, שימור תאים ותנועה תרמופורטית צנטריפוגלית. השיטה הוכחה בשני מינים: (i) Geobacillus stearothermophilus, חיידק תרמופילי פעיל המתרבה בכ-65 מעלות צלזיוס, שראינו שהוא נובט, גדל ושוחה בחימום בקנה מידה מיקרו; (ii) Thiobacillus sp., ארכיאה היפרתרמופילית בצורה מיטבית. ב-80 מעלות צלזיוס. עבודה זו סוללת את הדרך לתצפית פשוטה ובטוחה במיקרואורגניזמים תרמופיליים באמצעות כלי מיקרוסקופיה מודרניים ובמחיר סביר.
במשך מיליארדי שנים, החיים על פני כדור הארץ התפתחו כדי להסתגל למגוון רחב של תנאים סביבתיים הנחשבים לפעמים לקיצונים מנקודת המבט האנושית שלנו. בפרט, כמה מיקרואורגניזמים תרמופיליים (חיידקים, ארכיאה, פטריות) הנקראים תרמופילים משגשגים בטווח הטמפרטורות שבין 45°C ל- 122°C1, 2, 3, 4. תרמופילים חיים במערכות אקולוגיות שונות, כגון פתחי אוורור הידרותרמיים בים עמוקים, מעיינות חמים או אזורים געשיים. המחקר שלהם עורר עניין רב בעשורים האחרונים לפחות משתי סיבות. ראשית, אנו יכולים ללמוד מהם, למשל, כיצד תרמופילים 5, 6, אנזימים 7, 8 וממברנות 9 יציבים בטמפרטורות כה גבוהות, או כיצד תרמופילים יכולים לעמוד ברמות קיצוניות של קרינה10. שנית, הם מהווים בסיס ליישומים ביוטכנולוגיים חשובים רבים1,11,12 כגון ייצור דלק13,14,15,16, סינתזה כימית (דיהידרו, אלכוהול, מתאן, חומצות אמינו וכו')17, כרייה ביולוגית18 וביו-זרזים עמידים בחום7 ,11, 13. בפרט, תגובת שרשרת הפולימראז הידועה כיום (PCR)19 כוללת אנזים (Taq polymerase) שבודד מהחיידק התרמוספילי Thermus aquaticus, אחד התרמופילים הראשונים שהתגלו.
עם זאת, חקר התרמופילים אינו משימה קלה ואי אפשר לאלתר אותו בשום מעבדה ביולוגית. במיוחד, לא ניתן לצפות בתרמופילים חיים במבחנה עם כל מיקרוסקופ אור סטנדרטי, אפילו עם תאי חימום זמינים מסחרית, המדורגים בדרך כלל לטמפרטורות נמוכות כמו 40 מעלות צלזיוס. מאז שנות ה-90, רק קבוצות מחקר בודדות התמסרו להחדרת מערכות מיקרוסקופיה בטמפרטורה גבוהה (HTM). בשנת 1994 Glukh et al. תא החימום/קירור נוצר על בסיס שימוש בתא פלטייר השולט בטמפרטורה של נימים מלבניים סגורים כדי לשמור על אנאירוביות 20 . ניתן לחמם את המכשיר עד 100 מעלות צלזיוס בקצב של 2 מעלות צלזיוס לשנייה, מה שמאפשר למחברים לחקור את התנועתיות של החיידק ההיפרתרמופילי Thermotoga maritima21. בשנת 1999 Horn et al. פותח מכשיר דומה מאוד, המבוסס עדיין על שימוש בנימים מחוממים המתאימים למיקרוסקופיה מסחרית כדי לחקור חלוקת/חיבור תאים. לאחר תקופה ארוכה של חוסר פעילות יחסי, התחדש החיפוש אחר HTMs יעיל בשנת 2012, במיוחד בקשר לסדרת מאמרים של קבוצת Wirth שהשתמשו במכשיר שהומצא על ידי Horn et al. לפני 15 שנים נחקרה התנועתיות של מספר רב של ארכאיות, כולל היפרתרמופילים, בטמפרטורות של עד 100 מעלות צלזיוס באמצעות נימים מחוממים23,24. הם גם שינו את המיקרוסקופ המקורי כדי להשיג חימום מהיר יותר (מספר דקות במקום 35 דקות כדי להגיע לטמפרטורה שנקבעה) ולהשיג שיפוע טמפרטורה ליניארי של יותר מ-2 ס"מ על פני המדיום. זה מכשיר עיצוב שיפוע טמפרטורה (TGFD) שימש כדי ללמוד את הניידות של thermophiles רבים בתוך שיפועים טמפרטורה במרחקים רלוונטיים ביולוגית 24, 25.
חימום נימים סגורים אינו הדרך היחידה לצפות בתרמופילים חיים. בשנת 2012, Kuwabara et al. נעשה שימוש בתאי Pyrex חד פעמיים תוצרת בית אטומים בדבק עמיד בחום (Super X2; Cemedine, יפן). הדגימות הונחו על פלטת חימום שקופה זמינה מסחרית (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, יפן) המסוגלת להתחמם עד 110 מעלות צלזיוס, אך לא נועדה במקור להדמיה ביולוגית. המחברים צפו בחלוקה יעילה של חיידקים תרמופיליים אנאירוביים (Thermosipho globiformans, זמן הכפלה 24 דקות) ב-65 מעלות צלזיוס. בשנת 2020, Pulshen et al. חימום יעיל של כלי מתכת מסחריים (AttofluorTM, Thermofisher) הודגם באמצעות שני גופי חימום תוצרת בית: מכסה ובמה (תצורה בהשראת מכונת PCR). אסוציאציה זו מביאה לטמפרטורת נוזל אחידה ומונעת אידוי ועיבוי בתחתית המכסה. השימוש בטבעת O מונע חילופי גזים עם הסביבה. HTM זה, הנקרא סולפוסקופ, שימש לצילום Sulfolobus acidocaldarius ב-75°C27.
מגבלה מוכרת של כל המערכות הללו הייתה ההגבלה לשימוש במטרות אוויר, כל טבילת שמן אינה מתאימה לטמפרטורה כה גבוהה ולהדמיה דרך דגימות שקופות בעובי של יותר מ-1 מ"מ. מגבלה מוכרת של כל המערכות הללו הייתה ההגבלה לשימוש במטרות אוויר, כל טבילת שמן אינה מתאימה לטמפרטורה כה גבוהה ולהדמיה דרך דגימות שקופות בעובי של יותר מ-1 מ"מ. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив,мк е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачныц 1. חסרון מוכר של כל המערכות הללו היה ההגבלה לשימוש במטרות אוויר, שכן כל טבילת שמן לא התאימה לטמפרטורה כה גבוהה ולהדמיה באמצעות דגימות שקופות בעובי של מעל 1 מ"מ.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合踄口毫米厚的透明样品成像。 מגבלה מוכרת של כל המערכות הללו היא המגבלה של שימוש במראה מובלת באוויר, שכן כל טבילת שמן אינה מתאימה להדמיית דגימות שקופות בעובי של מעל 1 מ"מ בטמפרטורות גבוהות כל כך. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных обюъ, общепризнанным ружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы мобразци тобразцы тобразци мой. החיסרון המוכר של כל המערכות הללו הוא השימוש המוגבל בעדשות אוויר, כל טבילת שמן אינה מתאימה לטמפרטורות כה גבוהות ולהדמיה דרך דגימות שקופות בעובי של מעל 1 מ"מ.לאחרונה, מגבלה זו הוסרה על ידי Charles-Orzag et al. 28, שפיתח מכשיר שכבר אינו מספק חום סביב מערכת העניין, אלא בתוך זכוכית הכיסוי עצמה, מכוסה בשכבה דקה שקופה של נגד עשוי ITO (אינדיום-פח אוקסיד). ניתן לחמם את המכסה עד 75 מעלות צלזיוס על ידי העברת זרם חשמלי דרך השכבה השקופה. עם זאת, על המחבר גם לחמם את העדשה לאובייקט, אך לא יותר מ-65 מעלות צלזיוס, כדי לא לפגוע בה.
עבודות אלה מראות שפיתוח של מיקרוסקופיה אופטית יעילה בטמפרטורה גבוהה לא אומץ באופן נרחב, לעתים קרובות דורש ציוד תוצרת בית, ולעתים קרובות מושגת במחיר של רזולוציה מרחבית, וזה חיסרון רציני בהתחשב בכך שמיקרואורגניזמים תרמופיליים אינם גדולים מכמה בודדים. מיקרומטרים. נפח חימום מופחת הוא המפתח לפתרון שלוש בעיות טבועות ב-HTM: רזולוציה מרחבית ירודה, אינרציה תרמית גבוהה כאשר המערכת מתחממת וחימום מזיק של אלמנטים מסביב (שמן טבילה, עדשת אובייקטיבית... או ידיים של המשתמש) בטמפרטורות קיצוניות. ).
במאמר זה, אנו מציגים HTM לתצפית תרמופילים שאינו מבוסס על חימום התנגדות. במקום זאת, השגנו חימום מקומי באזור מוגבל של שדה הראייה של המיקרוסקופ על ידי הקרנת לייזר של מצע סופג אור. התפלגות הטמפרטורה הוצגה באמצעות מיקרוסקופ שלב כמותי (QPM). יעילותה של שיטה זו מודגמת על ידי Geobacillus stearothermophilus, חיידק תרמופילי תנועתי המתרבה בכ-65 מעלות צלזיוס ובעל זמן הכפלה קצר (כ-20 דקות), ו-Sulfolobus shibatae, היפרתרמופיל הגדל בצורה מיטבית ב-80 מעלות צלזיוס (ארכאה) להמחיש. קצב שכפול נורמלי ושחייה נצפו כפונקציה של הטמפרטורה. הלייזר HTM (LA-HTM) אינו מוגבל על ידי עובי הכיסוי או על ידי אופי המטרה (טבילת אוויר או שמן). זה מאפשר להשתמש בכל עדשה ברזולוציה גבוהה בשוק. הוא גם אינו סובל מחימום איטי עקב אינרציה תרמית (משיג חימום מיידי בקנה מידה של אלפיות שנייה) ומשתמש רק ברכיבים זמינים מסחרית. חששות הבטיחות החדשים היחידים קשורים לנוכחות של קרני לייזר חזקות (בדרך כלל עד 100 mW) בתוך המכשיר ואולי דרך העיניים, הדורשות משקפי מגן.
העיקרון של LA-HTM הוא להשתמש בלייזר כדי לחמם את המדגם באופן מקומי בתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ (איור 1א). לשם כך, הדגימה חייבת להיות סופגת אור. כדי להשתמש בכוח לייזר סביר (פחות מ-100 mW), לא הסתמכנו על ספיגת האור על ידי המדיום הנוזלי, אלא הגברנו באופן מלאכותי את הספיגה של הדגימה על ידי ציפוי המצע בננו-חלקיקי זהב (איור 1c). חימום ננו-חלקיקי זהב באור הוא בעל חשיבות מהותית לתחום הפלסמוניקה התרמית, עם יישומים צפויים בביו-רפואה, ננוכימיה או קצירת אור השמש29,30,31. במהלך השנים האחרונות, השתמשנו ב-LA-HTM זה במספר מחקרים הקשורים ליישומי פלזמה תרמית בפיזיקה, כימיה וביולוגיה. הקושי העיקרי בשיטה זו הוא בהצגת פרופיל הטמפרטורה הסופי, מכיוון שהטמפרטורה המוגברת מוגבלת לאזור בקנה מידה מיקרו בדגימה. הראינו שניתן להשיג מיפוי טמפרטורה באמצעות אינטרפרומטר גזירה רוחבית בארבעה אורכי גל, שיטה פשוטה, ברזולוציה גבוהה ורגישה מאוד למיקרוסקופיה כמותית של פאזות המבוססת על שימוש בסורגי עקיפה דו-ממדיים (הידועים גם כסורגים צולבים) 33,34,35,36. האמינות של טכניקת מיקרוסקופיה תרמית זו, המבוססת על מיקרוסקופ חזית גל מוצלבת (CGM), הוכחה בתריסר מאמרים שפורסמו בעשור האחרון37,38,39,40,41,42,43.
תוכנית התקנת מיקרוסקופ לייזר מקביל לחימום, עיצוב וטמפרטורה. ב גיאומטריה לדוגמה המורכבת מתא AttofluorTM המכיל כיסוי כיסוי מצופה בננו-חלקיקי זהב. ג הסתכלו היטב על המדגם (לא בקנה מידה). d מייצג את פרופיל קרן הלייזר האחיד ו-(ה) את פיזור הטמפרטורה המדומה לאחר מכן במישור המדגם של ננו-חלקיקי הזהב. f הוא פרופיל קרן לייזר טבעתי המתאים ליצירת טמפרטורה אחידה כפי שמוצג בהדמיה של התפלגות הטמפרטורה המתקבלת המוצגת ב-(g). סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר.
בפרט, לאחרונה השגנו חימום של תאי יונקים עם LA-HTM ו-CGM ועקבנו אחר תגובות הלם חום תאי בטווח של 37-42 מעלות צלזיוס, מה שמדגים את הישימות של טכניקה זו להדמיית תא חי יחיד. עם זאת, היישום של LA-HTM לחקר מיקרואורגניזמים בטמפרטורות גבוהות אינו חד משמעי, מכיוון שהוא דורש זהירות רבה יותר בהשוואה לתאי יונקים: ראשית, חימום תחתית המדיום בעשרות מעלות (ולא בכמה מעלות) מוביל. לשיפוע טמפרטורה אנכי חזק. יכול ליצור הסעה נוזלית 44 אשר, אם אינה מחוברת היטב למצע, עלולה לגרום לתנועה בלתי רצויה וערבוב של חיידקים. הסעה זו ניתנת לביטול על ידי הפחתת עובי שכבת הנוזל. לשם כך, בכל הניסויים המוצגים להלן, הונחו תרחיפים של חיידקים בין שני כיסויים בעובי של כ-15 מיקרומטר שהונחו בתוך כוס מתכת (AttofluorTM, Thermofisher, איור 1b,c). באופן עקרוני, ניתן להימנע מהסעה אם עובי הנוזל קטן מגודל הקרן של לייזר החימום. שנית, עבודה בגיאומטריה מוגבלת כזו יכולה לחנוק אורגניזמים אירוביים (ראה איור S2). ניתן להימנע מבעיה זו על ידי שימוש במצע חדיר לחמצן (או כל גז חיוני אחר), על ידי השארת בועות אוויר כלואות בתוך הכיסוי, או על ידי קידוח חורים בכיסוי העליון (ראה איור S1) 45. במחקר זה, בחרנו בפתרון האחרון (איורים 1b ו-S1). לבסוף, חימום בלייזר אינו מספק פיזור טמפרטורה אחיד. אפילו באותה עוצמה של קרן הלייזר (איור 1ד), פיזור הטמפרטורה אינו אחיד, אלא דומה לפיזור גאוס עקב דיפוזיה תרמית (איור 1e). כאשר המטרה היא לקבוע טמפרטורות מדויקות בשדה הראייה לחקר מערכות ביולוגיות, פרופילים לא אחידים אינם אידיאליים ויכולים גם להוביל לתנועה תרמופורטית של חיידקים אם הם לא נצמדים למצע (ראה איור S3, S4)39. לשם כך, השתמשנו במאפנן אור מרחבי (SLM) כדי לעצב את קרן הלייזר האינפרא אדום לפי צורת הטבעת (איור 1f) במישור הדגימה כדי להשיג פיזור טמפרטורה אחיד לחלוטין בתוך אזור גיאומטרי נתון. למרות דיפוזיה תרמית (איור 1 ד) 39, 42, 46. מניחים כיסוי עליון מעל צלחת מתכת (איור 1 ב) כדי למנוע אידוי של המדיום ולהתבונן לפחות כמה ימים. מכיוון שהכיסוי העליון הזה אינו אטום, ניתן להוסיף מדיום נוסף בקלות בכל עת במידת הצורך.
כדי להמחיש כיצד LA-HTM פועל ולהדגים את ישימותו במחקר תרמופילי, חקרנו את החיידק האירובי Geobacillus stearothermophilus, אשר להם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של סביב 60-65 מעלות צלזיוס. לחיידק יש גם דגלים ויכולת שחייה, מה שמספק אינדיקטור נוסף לפעילות תאית תקינה.
דגימות (איור 1b) הודגרו מראש ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ולאחר מכן הונחו במחזיק מדגם LA-HTM. הדגירה המוקדמת הזו היא אופציונלית, אך עדיין שימושית, משתי סיבות: ראשית, כאשר הלייזר מופעל, הוא גורם לתאים לגדול ולהתחלק מיד (ראה סרט M1 בחומרים משלימים). ללא דגירה מוקדמת, צמיחת חיידקים מתעכבת בדרך כלל בכ-40 דקות בכל פעם שאזור צפייה חדש מחומם על הדגימה. שנית, הדגירה המוקדמת של שעה אחת קידמה הידבקות של החיידקים לכיסוי הכיסוי, ומונעת מהתאים להיסחף מחוץ לשדה הראייה עקב תרמופורזה כאשר הלייזר הופעל (ראה סרט M2 בחומרים משלימים). תרמופורזה היא תנועה של חלקיקים או מולקולות לאורך שיפוע טמפרטורה, בדרך כלל מחם לקר, וחיידקים אינם יוצאי דופן43,47. השפעה בלתי רצויה זו בוטלה על פני שטח נתון באמצעות SLM לעיצוב קרן הלייזר ולהשגת חלוקת טמפרטורה שטוחה.
על איור. איור 2 מציג את התפלגות הטמפרטורה הנמדדת על ידי CGM המתקבלת על ידי הקרנת מצע זכוכית המצופה בננו-חלקיקי זהב באמצעות קרן לייזר טבעתית (איור 1f). התפלגות טמפרטורה שטוחה נצפתה על פני כל השטח המכוסה על ידי קרן הלייזר. אזור זה הוגדר ל-65 מעלות צלזיוס, טמפרטורת הגידול האופטימלית. מחוץ לאזור זה, עקומת הטמפרטורה יורדת באופן טבעי ל-\(1/r\) (כאשר \(r\) היא הקואורדינטה הרדיאלית).
מפת טמפרטורה של מדידות CGM המתקבלות באמצעות קרן לייזר טבעתית כדי להקרין שכבה של ננו-חלקיקי זהב כדי לקבל פרופיל טמפרטורה שטוח על פני שטח עגול. ב איזותרמיה של מפת הטמפרטורה (א). קו המתאר של קרן הלייזר מיוצג על ידי עיגול מנוקד אפור. הניסוי חזר על עצמו פעמיים (ראה חומרים משלימים, איור S4).
הכדאיות של תאי חיידקים נוטרה במשך מספר שעות באמצעות LA-HTM. על איור. 3 מציג את מרווח הזמן של ארבע תמונות שצולמו מסרט של 3 שעות ו-20 דקות (סרט M3, מידע משלים). נצפו חיידקים מתרבים באופן פעיל בתוך האזור המעגלי שהוגדר על ידי הלייזר שבו הטמפרטורה הייתה אופטימלית, והתקרבה ל-65 מעלות צלזיוס. לעומת זאת, צמיחת התאים הופחתה באופן משמעותי כאשר הטמפרטורה ירדה מתחת ל-50 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות.
תמונות עומק אופטיות של חיידקי G. stearothermophilus הגדלים לאחר חימום בלייזר בזמנים שונים, (א) t = 0 דקות, (ב) 1 שעה 10 דקות, (ג) 2 שעות 20 דקות, (ד) 3 שעות 20 דקות, מתוך 200 מופק מסרט של דקה אחת (סרט M3 מסופק במידע משלים) המוצמד על מפת הטמפרטורה המתאימה. הלייזר נדלק בזמן \(t=0\). איזותרמיות נוספו לתמונת העוצמה.
כדי לכמת עוד יותר את צמיחת התא ואת התלות שלו בטמפרטורה, מדדנו את העלייה בביומסה של מושבות שונות של חיידקים מבודדים בתחילה בשדה הראייה Movie M3 (איור 4). חיידקי האב שנבחרו בתחילת היווצרות יחידת יצירת מיני מושבות (mCFU) מוצגים באיור S6. מדידות המסה היבשה בוצעו עם מצלמת CGM 48 ששימשה למיפוי התפלגות הטמפרטורה. היכולת של ה-CGM למדוד משקל יבש וטמפרטורה היא החוזק של ה-LA-HTM. כצפוי, טמפרטורה גבוהה גרמה לצמיחה מהירה יותר של חיידקים (איור 4א). כפי שמוצג בחלקה החצי-לוגית באיור 4b, הצמיחה בכל הטמפרטורות באה בעקבות צמיחה מעריכית, כאשר הנתונים משתמשים בפונקציה המעריכית \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), כאשר \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – זמן יצירה (או זמן הכפלה), \( g =1/ \tau\) – קצב צמיחה (מספר חלוקות ליחידת זמן). על איור. 4c מציג את קצב הגדילה וזמן הייצור בהתאמה כפונקציה של הטמפרטורה. גידול מהיר של mCFUs מאופיינים ברוויה של גדילה לאחר שעתיים, התנהגות צפויה עקב צפיפות חיידקים גבוהה (בדומה לשלב הנייח בתרביות נוזלים קלאסיות). הצורה הכללית \(g\left(T\right)\) (איור 4c) תואמת את העקומה הדו-פאזית הצפויה עבור G. stearothermophilus עם קצב גדילה אופטימלי סביב 60-65 מעלות צלזיוס. התאם את הנתונים באמצעות מודל קרדינל (איור S5)49 כאשר \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) מעלות צלזיוס, מה שמתאים היטב לערכים אחרים שצוטטו בספרות49. למרות שהפרמטרים תלויי הטמפרטורה ניתנים לשחזור, קצב הצמיחה המרבי של \({G}_{0}\) עשוי להשתנות מניסוי אחד למשנהו (ראה איורים S7-S9 וסרט M4). בניגוד לפרמטרים של התאמת טמפרטורה, שצריכים להיות אוניברסליים, קצב הצמיחה המרבי תלוי בתכונות המדיום (זמינות חומרי הזנה, ריכוז חמצן) בתוך הגיאומטריה המיקרוסקופית הנצפית.
גידול חיידקים בטמפרטורות שונות. mCFU: Miniature Colony Forming Units. נתונים שהתקבלו מסרטון של חיידק בודד הגדל בשיפוע טמפרטורה (סרט M3). ב זהה ל-(א), סולם לוגריתמי למחצה. ג קצב צמיחה\(\tau\) וזמן ייצור\(g\) מחושבים מתוך רגרסיה לינארית (ב). פסי שגיאה אופקיים: טווח טמפרטורות שבו התרחבו mCFUs לשדה הראייה במהלך הצמיחה. פסי שגיאה אנכיים: שגיאת תקן רגרסיה ליניארית.
בנוסף לגדילה תקינה, חלק מהחיידקים צפו לפעמים לעין במהלך חימום בלייזר, שזו התנהגות צפויה עבור חיידקים עם דגלים. הסרט M5 במידע נוסף מציג פעילויות שחייה כאלה. בניסוי זה נעשה שימוש בקרינת לייזר אחידה ליצירת שיפוע טמפרטורה, כפי שמוצג באיורים 1d, e ו-S3. איור 5 מציג שני רצפי תמונה שנבחרו מהסרט M5 המראים שחיידק אחד מפגין תנועה כיוונית בעוד שכל החיידקים האחרים נשארים ללא תנועה.
שתי מסגרות הזמן (א) ו-(ב) מציגות שחייה של שני חיידקים שונים המסומנים בעיגולים מנוקדים. התמונות חולצו מהסרט M5 (סופקו כחומר משלים).
במקרה של G. stearothermophilus, התנועה הפעילה של חיידקים (איור 5) החלה מספר שניות לאחר הפעלת קרן הלייזר. תצפית זו מדגישה את התגובה הזמנית של מיקרואורגניזם תרמופילי זה לעלייה בטמפרטורה, כפי שכבר נצפה על ידי Mora et al. 24 . ניתן להמשיך ולחקור את הנושא של תנועתיות חיידקים ואפילו תרמוקסיס באמצעות LA-HTM.
אין לבלבל שחייה מיקרוביאלית עם סוגים אחרים של תנועה פיזית, כלומר (i) תנועה בראונית, הנראית כתנועה כאוטית ללא כיוון מוגדר, (ii) הסעה 50 ותרמופורזה 43, המורכבת בסחיפה קבועה של תנועה לאורך טמפרטורה מִדרוֹן.
G. stearothermophilus ידוע ביכולתו לייצר נבגים עמידים במיוחד (היווצרות נבגים) כאשר הוא נחשף לתנאי סביבה שליליים כהגנה. כאשר תנאי הסביבה חוזרים להיות נוחים, הנבגים נובטים, יוצרים תאים חיים ומחדשים את הצמיחה. למרות שתהליך נבג/נביטה זה ידוע, הוא מעולם לא נצפה בזמן אמת. באמצעות LA-HTM, אנו מדווחים כאן על התצפית הראשונה של אירועי נביטה ב-G. stearothermophilus.
על איור. 6a מציגה תמונות זמן-lapse של עומק אופטי (OT) שהושגו באמצעות סט CGM של 13 נבגים. במשך כל זמן האיסוף (15 שעות 6 דקות, \(t=0\) – תחילת חימום הלייזר), 4 מתוך 13 נבגים נבטו, בנקודות זמן עוקבות \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ו-\(11\) h \(30\)'. למרות שרק אחד מהאירועים הללו מוצג באיור 6, ניתן לראות 4 אירועי נביטה בסרט M6 בחומר המשלים. מעניין שהנביטה נראית אקראית: לא כל הנבגים נובטים ואינם נובטים בו-זמנית, למרות אותם שינויים בתנאי הסביבה.
זמן-lapse המורכב מ-8 תמונות OT (טבילת שמן, 60x, 1.25 NA מטרה) ו-(ב) אבולוציה של ביומסה של אגרגטים של G. stearothermophilus. ג (ב) מצויר בסולם חצי-לוג כדי להדגיש את הליניאריות של קצב הצמיחה (קו מקווקו).
על איור. 6b,c מציג את הביומסה של אוכלוסיות תאים בשדה הראייה כפונקציה של זמן לאורך כל תקופת איסוף הנתונים. ההתפרקות המהירה של המסה היבשה הנצפית ב-\(t=5\)h באיור. 6b, c, עקב יציאה של כמה תאים משדה הראייה. קצב הגידול של ארבעת האירועים הללו הוא \(0.77\pm 0.1\) h-1. ערך זה גבוה מקצב הגדילה הקשור באיור 3. 3 ו-4, שבהם תאים גדלים כרגיל. הסיבה לקצב הגדילה המוגבר של G. stearothermophilus מנבגים אינה ברורה, אך מדידות אלו מדגישות את העניין של LA-HTM ועובדות ברמת תא בודד (או ברמת mCFU בודד) כדי ללמוד עוד על הדינמיקה של חיי התא. .
כדי להדגים עוד יותר את הרבגוניות של LA-HTM וביצועיו בטמפרטורות גבוהות, בדקנו את הצמיחה של Sulfolobus shibatae, ארכיאה אסידופילית היפרתרמופילית עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 80°C51. בהשוואה ל-G. stearothermophilus, לארכיאה הללו יש גם מורפולוגיה שונה מאוד, הדומה לכדורים בגודל 1 מיקרון (קוקסי) ולא למוטות מוארכים (בצילונים).
איור 7a מורכב מתמונות עומק אופטיות עוקבות של S. shibatae mCFU שהושגו באמצעות CGM (ראה סרט עלילתי M7 בחומרים משלימים). mCFU זה גדל בסביבות 73°C, מתחת לטמפרטורה האופטימלית של 80°C, אך בטווח הטמפרטורות לצמיחה פעילה. צפינו באירועי ביקוע מרובים שגרמו ל-mCFUs להיראות כמו מיקרוגראפים של ארכאה לאחר מספר שעות. מתמונות OT אלה, ביומסה mCFU נמדדה לאורך זמן והוצגה באיור 7b. מעניין לציין ש- S. shibatae mCFUs הראו צמיחה ליניארית ולא את הצמיחה האקספוננציאלית שנראתה עם mCFUs של G. stearothermophilus. קיים דיון ארוך שנים 52 על אופי קצב גדילת התאים: בעוד שמחקרים מסוימים מדווחים על קצבי גדילה של חיידקים פרופורציונליים לגודלם (צמיחה מעריכית), אחרים מראים קצב קבוע (צמיחה ליניארית או דו-לינארית). כפי שהוסבר על ידי Tzur et al.53, ההבחנה בין צמיחה אקספוננציאלית ל-(בי) ליניארית דורשת דיוק של <6% במדידות ביומסה, דבר שאינו בהישג יד עבור רוב טכניקות QPM, אפילו הכוללות התערבות. כפי שהוסבר על ידי Tzur et al.53, ההבחנה בין צמיחה אקספוננציאלית ל-(בי) ליניארית דורשת דיוק של <6% במדידות ביומסה, דבר שאינו בהישג יד עבור רוב טכניקות QPM, אפילו הכוללות התערבות. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% вис достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. כפי שהוסבר על ידי Zur et al.53, ההבחנה בין צמיחה אקספוננציאלית ל-(בי)לינארית דורשת דיוק של <6% במדידות ביומסה, דבר שאינו ניתן להשגה עבור רוב שיטות QPM, אפילו באמצעות התערבות.כפי שהסבירו צור ואח'. 53, הבחנה בין צמיחה אקספוננציאלית ו(בי) ליניארית דורשת דיוק של פחות מ-6% במדידות ביומסה, דבר שאינו ניתן להשגה עבור רוב שיטות QPM, גם כאשר נעשה שימוש באינטרפרומטריה. CGM משיגה את הדיוק הזה עם דיוק תת-עמודים במדידות ביומסה36,48.
זמן-lapse המורכב מ-6 תמונות OT (טבילת שמן, 60x, NA מטרה 1.25) ו-(ב) אבולוציה של ביומסה מיקרו-CFU שנמדדה עם CGM. ראה סרט M7 למידע נוסף.
הגידול הליניארי לחלוטין של S. shibatae היה בלתי צפוי ועדיין לא דווח. עם זאת, צפויה צמיחה אקספוננציאלית, לפחות מכיוון שלאורך זמן, חייבות להתרחש חלוקות מרובות של 2, 4, 8, 16 … תאים. שיערנו שצמיחה ליניארית עשויה לנבוע מעיכוב תאים עקב אריזת תאים צפופה, בדיוק כפי שצמיחת התאים מואטת ובסופו של דבר מגיעה למצב רדום כאשר צפיפות התאים גבוהה מדי.
אנו מסכמים על ידי דיון בחמש נקודות העניין הבאות בתורן: הפחתת נפח החימום, הפחתת האינרציה התרמית, עניין בננו-חלקיקי זהב, עניין במיקרוסקופ שלב כמותי וטווח טמפרטורות אפשרי שבו ניתן להשתמש ב-LA-HTM.
בהשוואה לחימום התנגדות, חימום בלייזר המשמש לפיתוח HTM מציע מספר יתרונות, אותם אנו מדגים במחקר זה. בפרט, במדיה נוזלית בשדה הראייה של המיקרוסקופ, נפח החימום נשמר בתוך כמה (10 מיקרומטר) 3 נפחים. בדרך זו, רק החיידקים שנצפו פעילים, בעוד שחיידקים אחרים רדומים וניתן להשתמש בהם כדי להמשיך ולחקור את הדגימה - אין צורך לשנות את הדגימה בכל פעם שצריך לבדוק טמפרטורה חדשה. בנוסף, חימום בקנה מידה מיקרו מאפשר בחינה ישירה של טווח גדול של טמפרטורות: איור 4c התקבל מסרט של 3 שעות (סרט M3), שבדרך כלל דורש הכנה ובדיקה של מספר דגימות - אחת לכל אחת מהדגימות הנבדקות. y היא הטמפרטורה המייצגת את מספר הימים בניסוי. צמצום הנפח המחומם גם שומר על כל הרכיבים האופטיים שמסביב של המיקרוסקופ, במיוחד עדשת האובייקטיב, בטמפרטורת החדר, שהייתה בעיה מרכזית איתה התמודדה הקהילה עד כה. ניתן להשתמש ב-LA-HTM עם כל עדשה, כולל עדשות טבילה בשמן, והיא תישאר בטמפרטורת החדר גם בטמפרטורות קיצוניות בשדה הראייה. המגבלה העיקרית של שיטת החימום בלייזר עליה אנו מדווחים במחקר זה היא שתאים שאינם נדבקים או צפים עשויים להיות רחוקים משדה הראייה וקשים למחקר. פתרון עוקף יכול להיות שימוש בעדשות בהגדלה נמוכה כדי להשיג עליית טמפרטורה גדולה יותר של כמה מאות מיקרון. זהירות זו מלווה בירידה ברזולוציה המרחבית, אך אם המטרה היא לחקור את תנועת המיקרואורגניזמים, אין צורך ברזולוציה מרחבית גבוהה.
סולם הזמן לחימום (וקירור) המערכת \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) תלוי בגודלה, לפי החוק \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}}={L}^{2}/D\), כאשר \ (L\) הוא הגודל האופייני של מקור החום (קוטר קרן הלייזר במחקר שלנו הוא \(L\ בערך 100\) מיקרומטר), \(D\) הוא הדיפוזיטיביות התרמית של הסביבה (ממוצע אצלנו מארז, זכוכית ומים קצב דיפוזיה\(D\ בערך פי 2 {10}^{-7}\) m2/s לכן, במחקר זה, תגובות זמן בסדר גודל של 50 ms, כלומר, כמעט-מיידיות). ניתן לצפות לשינויי טמפרטורה, כינון מיידי זה של עליית טמפרטורה לא רק מקצר את משך הניסוי, אלא גם מאפשר תזמון מדויק \(t=0\) לכל מחקר דינמי של השפעות הטמפרטורה.
השיטה המוצעת שלנו חלה על כל מצע סופג אור (לדוגמה, דגימות מסחריות עם ציפוי ITO). עם זאת, ננו-חלקיקי זהב מסוגלים לספק ספיגה גבוהה באינפרא אדום וספיגה נמוכה בטווח הנראה, שהמאפיינים האחרונים שלהם מעניינים עבור תצפית אופטית יעילה בטווח הנראה, במיוחד בעת שימוש בפלורסנטיות. בנוסף, הזהב תואם ביולוגי, אינרטי מבחינה כימית, צפיפות אופטית ניתנת להתאמה מ-530 ננומטר לאינפרא אדום קרוב, והכנת הדגימה פשוטה וחסכונית29.
מיקרוסקופ חזית גל רוחבי גרד (CGM) מאפשר לא רק מיפוי טמפרטורה בקנה מידה מיקרו, אלא גם ניטור ביומסה, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד (אם אין צורך) בשילוב עם LA-HTM. במהלך העשור האחרון פותחו טכניקות אחרות של מיקרוסקופ טמפרטורה, במיוחד בתחום הביו-הדמיה, ורובן דורשות שימוש בבדיקות פלורסנט רגישות לטמפרטורה54,55. עם זאת, שיטות אלו זכו לביקורת וכמה דיווחים מדדו שינויי טמפרטורה לא מציאותיים בתוך תאים, אולי בשל העובדה שהקרינה תלויה בגורמים רבים מלבד הטמפרטורה. בנוסף, רוב הבדיקות הפלורסנט אינן יציבות בטמפרטורות גבוהות. לכן, QPM ובפרט CGM מייצגים טכניקת מיקרוסקופיה טמפרטורה אידיאלית לחקר חיים בטמפרטורות גבוהות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.
מחקרים של S. shibatae, שחיים בצורה מיטבית ב-80 מעלות צלזיוס, מראים שניתן ליישם את LA-HTM לחקר היפרתרמופילים, לא רק תרמופילים פשוטים. באופן עקרוני, אין הגבלה לטווח הטמפרטורות שניתן להגיע אליו באמצעות LA-HTM, ואפילו לטמפרטורות מעל 100 מעלות צלזיוס ניתן להגיע בלחץ אטמוספרי ללא רתיחה, כפי שהדגימה קבוצת ה-38 שלנו ביישומי כימיה הידרותרמית באטמוספרי. לחץ A. לייזר משמש לחימום ננו-חלקיקי זהב 40 באותו אופן. לפיכך, ל-LA-HTM יש פוטנציאל לשמש לצפייה בהיפרתרמופילים חסרי תקדים עם מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה גבוהה סטנדרטית בתנאים סטנדרטיים (כלומר בלחץ סביבתי).
כל הניסויים בוצעו באמצעות מיקרוסקופ תוצרת בית, כולל תאורת Köhler (עם LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), מחזיק דגימה עם תנועת xy ידנית, מטרות (Olympus, 60x, 0.7 NA, air, LUCPlanFLN60X או 60x, Oil NA, 1.25 NA , UPLFLN60XOI), מצלמת CGM (רשת צולבת QLSI, גובה 39 מיקרומטר, 0.87 מ"מ מחיישן מצלמת Andor Zyla) לספק הדמיה בעוצמה וחזית גל, ומצלמת sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, מצב 16 סיביות, מ-Hamatsu) כדי להקליט את נתונים המוצגים באיור 5 (שחייה חיידקית). מפצל האלומות הדיכרואי הוא קצה BrightLine של 749 ננומטר (Semrock, FF749-SDi01). המסנן בקדמת המצלמה הוא מסנן 694 קצר מעבר (FF02-694/SP-25, Semrock). לייזר טיטניום ספיר (לייזר Verdi G10, 532 ננומטר, 10 W, חלל לייזר צונאמי שאוב, ספקטרה-פיזיקה באיור 2-5, הוחלף עוד בלייזר Millenia, Spectraphysics 10 W, חלל לייזר Mira שאוב, קוהרנטי, עבור איור 2 -5). 6 ו-7) מוגדרים לאורך הגל \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) ננומטר, התואם לספקטרום התהודה הפלסמוני של חלקיקי זהב. מאפננים אור מרחביים (1920 × 1152 פיקסלים) נרכשו מ-Meadowlark Optics. ההולוגרמות חושבו באמצעות האלגוריתם של Gerchberg-Saxton כמתואר בקישור 39.
מיקרוסקופיה צולבת גלים (CGM) היא טכניקת מיקרוסקופיה אופטית המבוססת על שילוב של רשת עקיפה דו-ממדית (הידועה גם כ-cross grating) במרחק של מילימטר אחד מהחיישן של מצלמה קונבנציונלית. הדוגמה הנפוצה ביותר ל-CGM שהשתמשנו בה במחקר זה נקראת אינטרפרומטר משמרת רוחבית בארבעה אורכי גל (QLSI), כאשר הרשת הצולבת מורכבת מדפוס לוח דמקה בעוצמה/שלב שהוצגה ורשומה בפטנט על ידי Primot et al. בשנת 200034. קווי הסורג האנכיים והאופקיים יוצרים צללים דמויי רשת על החיישן, שאת העיוות שלהם ניתן לעבד מספרית בזמן אמת כדי להשיג את העיוות האופטי של חזית הגל (או פרופיל הפאזה המקביל) של האור הנכנס. בשימוש במיקרוסקופ, מצלמת CGM יכולה להציג את הפרש הנתיב האופטי של אובייקט מצולם, הידוע גם בשם עומק אופטי (OT), עם רגישות בסדר גודל של ננומטר36. בכל מדידת CGM, על מנת לבטל פגמים כלשהם ברכיבים האופטיים או באלומות, יש לצלם תמונת ייחוס OT ראשונית ולהוריד מכל תמונות עוקבות.
מיקרוסקופ טמפרטורה בוצע באמצעות מצלמת CGM כמתואר בהפניה. 32. בקיצור, חימום נוזל משנה את מקדם השבירה שלו, ויוצר אפקט של עדשה תרמית שמעוות את הקרן הפוגעת. עיוות זה של חזית הגל נמדד על ידי ה-CGM ומעובד באמצעות אלגוריתם דה-קונבולוציה כדי להשיג פיזור טמפרטורה תלת מימדי בתווך הנוזלי. אם ננו-חלקיקי הזהב מפוזרים באופן שווה לאורך המדגם, ניתן לבצע מיפוי טמפרטורה באזורים ללא חיידקים כדי לייצר תמונות טובות יותר, וזה מה שאנו עושים לפעמים. תמונת ה-CGM הייחוס נרכשה ללא חימום (כשהלייזר כבוי) ולאחר מכן נלכדה באותו מיקום בתמונה כשהלייזר פועל.
מדידת מסה יבשה מושגת באמצעות אותה מצלמת CGM המשמשת להדמיית טמפרטורה. תמונות התייחסות ל-CGM התקבלו על ידי הזזה מהירה של המדגם ב-x וב-y במהלך החשיפה כאמצעי לממוצע כל אי-הומוגניות ב-OT עקב נוכחות של חיידקים. מתמונות OT של חיידקים, הביומסה שלהם התקבלה באמצעות מכלול תמונות על פני אזורים שנבחרו באמצעות אלגוריתם הפילוח הביתי של Matlab (ראה סעיף קטן "קוד מספרי"), בעקבות ההליך המתואר ב- ref. 48. בקיצור, אנו משתמשים ביחס \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), כאשר \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) היא תמונת העומק האופטית, \(m\) היא המשקל היבש ו-\({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) הוא קבוע. בחרנו \({{{{\rm{\alpha)))))))=0.18\) µm3/pg, שהוא קבוע אופייני לתאים חיים.
כיסוי כיסוי בקוטר 25 מ"מ ובעובי 150 מיקרומטר מצופה בננו-חלקיקי זהב הונח לתוך תא AttofluorTM (Thermofisher) עם ננו-חלקיקי הזהב פונים כלפי מעלה. Geobacillus stearothermophilus תורגל מראש למשך הלילה במדיום LB (200 סל"ד, 60 מעלות צלזיוס) לפני כל יום של ניסויים. טיפה של 5 μl של תרחיף של G. stearothermophilus עם צפיפות אופטית (OD) של 0.3 עד 0.5 הונחה על כיסוי כיסוי עם ננו-חלקיקי זהב. לאחר מכן, כיסוי עגול בקוטר 18 מ"מ עם חור בקוטר 5 מ"מ במרכז הושמט על הטיפה, ו-5 μl של תרחיף חיידקים עם אותה צפיפות אופטית הוחל שוב ושוב על מרכז החור. הבארות על כיסויי כיסוי הוכנו בהתאם לנוהל המתואר ב- ref. 45 (ראה מידע משלים למידע נוסף). לאחר מכן הוסף 1 מ"ל של מדיום LB לכיסוי הכיסוי כדי למנוע מהשכבה הנוזלית להתייבש. את הכיסוי האחרון מניחים מעל המכסה הסגור של תא Attofluor™ כדי למנוע אידוי של המדיום במהלך הדגירה. לניסויי נביטה השתמשנו בנבגים, שלאחר ניסויים קונבנציונליים כיסו לפעמים את הכיסוי העליון. שיטה דומה שימשה להשגת Sulfolobus shibatae. שלושה ימים (200 סל"ד, 75 מעלות צלזיוס) של גידול מקדים של Thiobacillus serrata בוצעו במדיום 182 (DSMZ).
דגימות של ננו-חלקיקי זהב הוכנו על ידי ליתוגרפיה של בלוק קופולימר מיסלרי. תהליך זה מתואר בפירוט בפרק. 60. בקצרה, מיצלות העוטפות יוני זהב סונתזו על ידי ערבוב הקופולימר עם HAuCl4 בטולואן. לאחר מכן טבלו את הכיסויים המנוקים בתמיסה וטופלו בקרינת UV בנוכחות חומר מפחית לקבלת זרעי זהב. לבסוף, זרעי זהב גדלו על ידי מגע של כיסוי כיסוי עם תמיסה מימית של KAuCl4 ואתנולמין במשך 16 דקות, מה שהביא לסידור מעין-מחזורי ואחיד מאוד של חלקיקי זהב לא כדוריים באינפרא אדום הקרוב.
כדי להמיר את האינטרפרוגרמות לתמונות OT, השתמשנו באלגוריתם תוצרת בית, כמפורט בקישור. 33 והוא זמין כחבילת Matlab במאגר הציבורי הבא: https://github.com/baffou/CGMprocess. החבילה יכולה לחשב עוצמה ותמונות OT בהתבסס על אינטרפרוגרמות מוקלטות (כולל תמונות התייחסות) ומרחקי מערך המצלמה.
כדי לחשב את תבנית הפאזה שהוחלה על SLM כדי לקבל פרופיל טמפרטורה נתון, השתמשנו באלגוריתם תוצרת בית שפותח בעבר 39,42 אשר זמין במאגר הציבורי הבא: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. הקלט הוא שדה הטמפרטורה הרצוי, אותו ניתן להגדיר באופן דיגיטלי או באמצעות תמונת bmp מונוכרום.
כדי לפלח את התאים ולמדוד את משקלם היבש, השתמשנו באלגוריתם Matlab שלנו שפורסם במאגר הציבורי הבא: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. בכל תמונה, על המשתמש ללחוץ על החיידק או ה-mCFU המעניין, להתאים את רגישות השרביט ולאשר את הבחירה.
למידע נוסף על עיצוב מחקר, עיין בתקציר דוח מחקר הטבע המקושר למאמר זה.
נתונים התומכים בתוצאות מחקר זה זמינים מהמחברים בהתאמה לפי בקשה סבירה.
קוד המקור המשמש במחקר זה מפורט בסעיף שיטות, וניתן להוריד גרסאות ניפוי באגים מ-https://github.com/baffou/ במאגרים הבאים: SLM_temperatureShaping, CGMprocess ו-CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK תובנה לגבי תרמופילים ויישומי הספקטרום הרחב שלהם. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK תובנה לגבי תרמופילים ויישומי הספקטרום הרחב שלהם.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK סקירה כללית של תרמופילים והיישום הרחב שלהם. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ו-Sharma AK הבנה עמוקה של thermophiles ומגוון רחב של יישומים.3 ביוטכנולוגיה 6, 81 (2016).