פרוטאומיקה מקיפה חושפת סמנים ביולוגיים של נוזל מוח שדרתי במחלת אלצהיימר אסימפטומטית ותסמינית

מחלת אלצהיימר (AD) חסרה סמנים ביולוגיים של חלבון המשקפים את הפתופיזיולוגיה הבסיסית המרובה שלה, ומעכבים את התקדמות האבחון והטיפול. כאן, אנו משתמשים בפרוטאומיקה מקיפה כדי לזהות סמנים ביולוגיים של נוזל מוחי (CSF) המייצגים מגוון רחב של פתופיזיולוגיה של AD. ספקטרומטריית מסה מרובה זיהתה כ-3,500 וכ-12,000 חלבונים ב-AD CSF ובמוח, בהתאמה. ניתוח הרשת של פרוטום המוח פתר 44 מודולים של מגוון ביולוגי, מתוכם 15 חופפים לפרוטאום הנוזל השדרתי. סמני ה-CSF AD במודולים החופפים הללו מקופלים לחמש קבוצות חלבון, המייצגות תהליכים פתופיזיולוגיים שונים. הסינפסות והמטבוליטים במוח ה-AD יורדים, אך ה-CSF עולה, בעוד שקבוצות המיאלינציה והחיסון העשירות בגליאליות במוח וב-CSF עולות. העקביות וסגוליות המחלה של השינויים בפאנל אושרו ביותר מ-500 דגימות נוספות של CSF. קבוצות אלו זיהו גם תת-קבוצות ביולוגיות בAD אסימפטומטי. בסך הכל, תוצאות אלו מהוות צעד מבטיח לקראת כלי סמנים ביולוגיים מבוססי אינטרנט עבור יישומים קליניים ב-AD.
מחלת אלצהיימר (AD) היא הגורם השכיח ביותר לדמנציה נוירודגנרטיבית ברחבי העולם ומאופיינת במגוון רחב של הפרעות בתפקוד המערכת הביולוגית, כולל העברה סינפטית, חסינות מתווכת גליה ומטבוליזם מיטוכונדריאלי (1-3). עם זאת, סמני החלבון המבוססים שלה עדיין מתמקדים באיתור חלבון עמילואיד וטאו, ולכן אינם יכולים לשקף את הפתופיזיולוגיה המגוונת הזו. סמנים ביולוגיים של חלבון "הליבה" הנמדדים בצורה האמינה ביותר בנוזל השדרה (CSF) כוללים (i) עמילואיד בטא פפטיד 1-42 (Aβ1-42), המשקף את היווצרותם של פלאקים עמילואידים בקליפת המוח; (ii) total tau, סימן לניוון האקסון; (iii) פוספו-טאו (p-tau), נציג של היפר-פוספורילציה פתולוגית של טאו (4-7). למרות שהסמנים הביולוגיים של נוזל השדרה הקלו מאוד על זיהוי מחלות חלבון AD "מסומנות" (4-7), הם מייצגים רק חלק קטן מהביולוגיה המורכבת שמאחורי המחלה.
היעדר המגוון הפתופיזיולוגי של סמנים ביולוגיים של AD הוביל לאתגרים רבים, כולל (i) חוסר היכולת לזהות ולכמת את ההטרוגניות הביולוגית של חולי AD, (ii) מדידה לא מספקת של חומרת המחלה והתקדמות, במיוחד בשלב הפרה-קליני, וכן ( iii) פיתוח תרופות טיפוליות שלא הצליחו לפתור לחלוטין את כל ההיבטים של הידרדרות נוירולוגית. ההסתמכות שלנו על פתולוגיה נקודתית לתיאור AD ממחלות קשורות רק מחמירה את הבעיות הללו. יותר ויותר עדויות מראות שלרוב הקשישים עם דמנציה יש יותר ממאפיין פתולוגי אחד של ירידה קוגניטיבית (8). עד 90% או יותר מהאנשים עם פתולוגיה של AD סובלים גם ממחלות כלי דם, תכלילים של TDP-43 או מחלות ניווניות אחרות (9). הפרופורציות הגבוהות הללו של חפיפה פתולוגית שיבשו את מסגרת האבחון הנוכחית שלנו לדמנציה, ויש צורך בהגדרה פתופיזיולוגית מקיפה יותר של המחלה.
לאור הצורך הדחוף במגוון של סמנים ביולוגיים של AD, התחום מאמץ יותר ויותר את שיטת "אומיקה" המבוססת על המערכת הכוללת לגילוי סמנים ביולוגיים. הברית התרופות Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance הושקה ב-2014 והיא נמצאת בחזית התוכנית. מאמץ רב תחומי זה של המכונים הלאומיים לבריאות, האקדמיה והתעשייה שואף להשתמש באסטרטגיות מבוססות מערכת כדי להגדיר טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של AD ולפתח אסטרטגיות אבחון ואסטרטגיות טיפול במגוון ביולוגי (10). כחלק מפרויקט זה, פרוטאומיקת רשת הפכה לכלי מבטיח לקידום סמנים ביולוגיים מבוססי מערכת ב-AD. גישה מונעת נתונים בלתי משוחדת זו מארגנת מערכי נתונים מורכבים של פרוטאומיקה לקבוצות או "מודולים" של חלבונים משותפים הקשורים לסוגי תאים, אברונים ותפקודים ביולוגיים ספציפיים (11-13). כמעט 12 מחקרי פרוטאומיקה ברשת עתירי מידע נערכו על מוח AD (13-23). בסך הכל, ניתוחים אלה מצביעים על כך שהפרוטום של רשת המוח של AD שומר על ארגון מודולרי שמור מאוד בקבוצות עצמאיות ובאזורים מרובים בקליפת המוח. בנוסף, חלק מהמודולים הללו מציגים שינויים הניתנים לשחזור בשפע הקשור ל-AD על פני מערכי נתונים, המשקפים את הפתופיזיולוגיה של מחלות מרובות. ביחד, ממצאים אלה מדגימים נקודת עיגון מבטיחה לגילוי של פרוטום רשת המוח כסמן ביולוגי מבוסס מערכת ב-AD.
על מנת להפוך את פרוטום רשת המוח של AD לסמנים ביולוגיים מבוססי מערכת שימושיים קלינית, שילבנו את הרשת הנגזרת מהמוח עם הניתוח הפרוטאומי של AD CSF. גישה משולבת זו הובילה לזיהוי של חמש קבוצות מבטיחות של סמנים ביולוגיים של CSF הקשורים למגוון רחב של פתופיזיולוגיה מבוססת מוח, כולל סינפסות, כלי דם, מיאלינציה, דלקת וחוסר תפקוד של מסלולים מטבוליים. אימתנו בהצלחה את לוחות הסמנים הביולוגיים הללו באמצעות ניתוחי שכפול מרובים, כולל יותר מ-500 דגימות CSF ממחלות ניווניות שונות. ניתוחי אימות אלה כוללים בחינת יעדים קבוצתיים ב-CSF של חולים עם AD אסימפטומטי (AsymAD) או הצגת עדויות להצטברות עמילואיד לא תקינה בסביבה קוגניטיבית תקינה. ניתוחים אלה מדגישים את ההטרוגניות הביולוגית המשמעותית באוכלוסיית AsymAD ומזהים סמני פאנל שעשויים להיות מסוגלים לתת סוג של פרטים בשלבים המוקדמים ביותר של המחלה. בסך הכל, תוצאות אלו מייצגות שלב מרכזי בפיתוח של כלי סמנים ביולוגיים של חלבון המבוססים על מערכות מרובות שיכולות לפתור בהצלחה רבים מהאתגרים הקליניים העומדים בפני AD.
המטרה העיקרית של מחקר זה היא לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של נוזל מוחי המשקפים פתופיזיולוגיה שונים המבוססים על המוח המובילות ל-AD. איור S1 מתאר את מתודולוגיית המחקר שלנו, הכוללת (i) ניתוח מקיף המונע על ידי ממצאים ראשוניים של AD CSF והפרוטאום המוח ברשת לזיהוי סמנים ביולוגיים מרובים של מחלות CSF הקשורות למוח, ו-(ii) שכפול שלאחר מכן סמנים ביולוגיים אלה נמצאים במספר מוחי-שדרתי עצמאי. קבוצות נוזלים. המחקר המכוון לגילוי התחיל בניתוח של הביטוי הדיפרנציאלי של CSF ב-20 אנשים נורמליים מבחינה קוגניטיבית ו-20 חולי AD במרכז לחקר מחלת האלצהיימר אמורי גויזואטה (ADRC). האבחנה של AD מוגדרת כהפרעה קוגניטיבית משמעותית בנוכחות Aβ1-42 נמוך ורמות גבוהות של טאו ו-p-tau בנוזל השדרה [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (טבלה S1A). לביקורת (MoCA ממוצע, 26.7 ± 2.2) היו רמות תקינות של סמנים ביולוגיים של CSF.
CSF אנושי מאופיין בטווח דינמי של שפע חלבון, שבו אלבומין וחלבונים בשפע אחרים יכולים למנוע זיהוי של חלבונים בעלי עניין (24). כדי להגדיל את עומק גילוי החלבון, הסרנו את 14 החלבונים הראשונים בשפע מכל דגימת CSF לפני ניתוח ספקטרומטריית מסה (24). סך של 39,805 פפטידים זוהו על ידי טרשת נפוצה, שמופו ל-3691 פרוטאומים ב-40 דגימות. כימות החלבון מתבצע על ידי תיוג מספר טנדם מסה (TMT) (18, 25). על מנת לפתור את הנתונים החסרים, כללנו רק את אותם חלבונים שכומתו בלפחות 50% מהדגימות בניתוח שלאחר מכן, ובכך כימתנו לבסוף 2875 פרוטאומים. בשל ההבדל המשמעותי ברמות שפע החלבון הכולל, דגימת ביקורת נחשבה סטטיסטית כחריגה (13) ולא נכללה בניתוח שלאחר מכן. ערכי השפע של 39 הדגימות הנותרות הותאמו לפי גיל, מגדר ושונות אצווה (13-15, 17, 18, 20, 26).
באמצעות ניתוח t-test סטטיסטי כדי להעריך ביטוי דיפרנציאלי במערך נתוני הרגרסיה, ניתוח זה זיהה חלבונים שרמות השפע שלהם השתנו באופן משמעותי (P <0.05) בין מקרי הביקורת ל-AD (טבלה S2A). כפי שמוצג באיור 1A, השפע של סך של 225 חלבונים ב-AD הצטמצם באופן משמעותי, והשפע של 303 חלבונים גדל באופן משמעותי. חלבונים אלה המובעים בצורה דיפרנציאלית כוללים מספר סמני AD של נוזל השדרה שזוהו בעבר, כגון חלבון טאו הקשור למיקרו-צינוריות (MAPT; P = 3.52 × 10-8), נוירופילמנט (NEFL; P = 6.56 × 10-3), חלבון הקשור לצמיחה 43 (GAP43; P = 1.46 × 10-5), חלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3; P = 2.00 × 10-5), Chitinase 3 כמו 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10-6), גרנולין עצבי (NRGN; P = 3.43 × 10−4) וגורם גדילה עצבי VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). עם זאת, זיהינו גם יעדים חשובים מאוד, כגון מעכב ניתוק GDP 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) וקשירת סידן מודולרית 1 הקשורה ל-SPARC (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). ניתוח ג'ין אונטולוגיה (GO) של 225 חלבונים מופחתים באופן משמעותי גילה קשרים הדוקים עם תהליכי נוזל גוף כמו חילוף חומרים של סטרואידים, קרישת דם ופעילות הורמונים (איור 1B וטבלה S2B). לעומת זאת, החלבון המוגבר באופן משמעותי של 303 קשור קשר הדוק למבנה התא ולמטבוליזם האנרגיה.
(א) עלילת הר הגעש מציגה את השינוי בקפל log2 (ציר x) ביחס לערך ה-P הסטטיסטי -log10 (ציר y) המתקבל על ידי מבחן t, המשמש לזיהוי ביטוי דיפרנציאלי בין הבקרה (CT) לבין מקרי AD של פרוטום CSF מכל החלבונים. חלבונים עם רמות מופחתות משמעותית (P <0.05) ב-AD מוצגים בכחול, בעוד חלבונים עם רמות מוגברות משמעותית במחלה מוצגים באדום. החלבון הנבחר מסומן. (ב) מונחי ה-GO המובילים הקשורים לחלבון מופחתים באופן משמעותי (כחול) ומוגברים (אדום) ב- AD. מציג את שלושת מונחי ה-GO עם ציוני ה-z הגבוהים ביותר בתחומי תהליכים ביולוגיים, פונקציות מולקולריות ורכיבים תאיים. (ג) טרשת נפוצה מדדה את רמת MAPT במדגם CSF (משמאל) והמתאם שלה עם רמת ELISA tau במדגם (מימין). מוצג מקדם המתאם של פירסון עם ערך ה-P הרלוונטי. בשל היעדר נתוני ELISA למקרה אחד של AD, נתונים אלה כוללים ערכים עבור 38 מתוך 39 המקרים המנותחים. (ד) ניתוח אשכולות מפוקח (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) מותאם P <0.01) על הביקורת ועל AD CSF מצאו דגימות תוך שימוש ב-65 החלבונים שהשתנו בצורה המשמעותית ביותר במערך הנתונים. תקן, נרמל.
הרמה הפרוטאומית של MAPT קשורה קשר הדוק לרמת ELISA tau שנמדדה באופן עצמאי (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; איור 1C), התומכת בתקפות מדידת הטרשת הנפוצה שלנו. לאחר עיכול טריפסין ברמה של חלבון מבשר עמילואיד (APP), הפפטידים הספציפיים לאיזופורמים הממופים לקצה ה-C של Aβ1-40 ו-Aβ1-42 לא ניתנים למינון ביעילות (27, 28). לכן, לפפטידים של APP שזיהינו אין שום קשר לרמות ELISA Aβ1-42. על מנת להעריך את הביטוי הדיפרנציאלי של כל מקרה, השתמשנו בחלבונים בעלי ביטוי דיפרנציאלי עם P <0.0001 [שיעור גילוי כוזב (FDR) מתוקן P <0.01] כדי לבצע ניתוח אשכולות מפוקח של הדגימות (טבלה S2A). כפי שמוצג באיור 1D, 65 החלבונים המשמעותיים ביותר הללו יכולים לאסוף דגימות בצורה נכונה בהתאם למצב המחלה, למעט מקרה אחד של AD עם מאפיינים דמויי בקרה. מתוך 65 החלבונים הללו, 63 עלו ב-AD, בעוד שרק שניים (CD74 ו-ISLR) ירדו. בסך הכל, ניתוחי נוזל מוחי אלה זיהו מאות חלבונים ב-AD שעשויים לשמש כסמנים ביולוגיים למחלה.
לאחר מכן ביצענו ניתוח רשת עצמאי של פרוטום המוח של AD. קבוצת המוח של גילוי זה כללה קליפת מוח קדם-מצחית דורסולטרלית (DLPFC) ממקרי ביקורת (n=10), מחלת פרקינסון (PD; n=10), AD/PD מעורבת (n=10) ו-AD (n=10). ) דוגמה. אמרי גויזואטה ADRC. הנתונים הדמוגרפיים של 40 המקרים הללו תוארו בעבר (25) והם מסוכמים בטבלה S1B. השתמשנו ב-TMT-MS כדי לנתח את 40 רקמות המוח הללו ואת קבוצת השכפול של 27 מקרים. בסך הכל, שני מערכי הנתונים המוחיים הללו ייצרו 227,121 פפטידים ייחודיים, שמופו ל-12,943 פרוטאומים (25). רק אותם חלבונים שכומתו בלפחות 50% מהמקרים נכללו בחקירות שלאחר מכן. מערך הנתונים הסופי של הגילוי מכיל 8817 חלבונים מכמתים. התאם את רמות שפע החלבון על סמך גיל, מגדר ומרווח לאחר המוות (PMI). ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי של מערך הנתונים לאחר רגרסיה הראה כי יותר מ-2000 רמות חלבון השתנו באופן משמעותי [P <0.05, אנליזה של שונות (ANOVA)] בשתי קבוצות מחלה או יותר. לאחר מכן, ביצענו ניתוח אשכולות מפוקח המבוסס על החלבונים המובעים בצורה דיפרנציאלית, ו-P <0.0001 בהשוואות AD/בקרה ו/או AD/PD (איור S2, A ו-B, טבלה S2C). 165 החלבונים שהשתנו מאוד מתארים בבירור מקרים עם פתולוגיה של AD מדגימות הבקרה וה-PD, מה שמאשר את השינויים החזקים הספציפיים ל-AD בכל הפרוטאומה.
לאחר מכן השתמשנו באלגוריתם בשם Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) כדי לבצע ניתוח רשת על הפרוטאום המוחי שהתגלה, אשר מארגן את מערך הנתונים לתוך מודולי חלבון עם דפוסי ביטוי דומים (11-13). הניתוח זיהה 44 מודולים (M) חלבונים משותפים, ממוינים וממוספרים מהגדול ביותר (M1, n = 1821 חלבונים) לקטן ביותר (M44, n = 34 חלבונים) (איור 2A וטבלה S2D)). כפי שהוזכר לעיל (13) חשב את פרופיל הביטוי המייצג או החלבון האופייני של כל מודול, ותאם אותו עם מצב המחלה ופתולוגיה של AD, כלומר, קבע את הברית של רישום מחלת האלצהיימר (CERAD) וציון Braak (איור 2B). בסך הכל, 17 מודולים היו קשורים באופן מובהק לנוירופתולוגיה של AD (P <0.05). רבים מהמודולים הקשורים למחלה עשירים גם בסמנים ספציפיים לסוג תא (איור 2B). כפי שהוזכר לעיל (13), העשרת סוג התא נקבעת על ידי ניתוח חפיפת המודול ורשימת ההתייחסות של גנים ספציפיים לסוג התא. גנים אלה נגזרים מנתונים שפורסמו בנוירונים מבודדים של עכברים, אנדותל ותאי גליה. ניסוי רצף RNA (RNA-seq) (29).
(א) גלה את ה-WGCNA של הפרוטאום במוח. (ב) ניתוח דו-משקל בינוני (BiCor) של חלבון החתימה המודולרי (המרכיב העיקרי הראשון של ביטוי חלבון מודולרי) עם מאפיינים נוירופתולוגיים AD (למעלה), כולל ציוני CERAD (Aβ) וציוני Braak (סבכים). העוצמות של מתאם חיובי (אדום) ושלילי (כחול) מוצגות על ידי מפת חום בשני צבעים, וכוכביות מצביעות על מובהקות סטטיסטית (P <0.05). השתמש ב-Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (למטה) כדי להעריך את הקשר בין סוג התא של כל מודול חלבון. עוצמת ההצללה האדומה מצביעה על מידת ההעשרה של סוג התא, והכוכבית מצביעה על מובהקות סטטיסטית (P<0.05). השתמש בשיטת BH כדי לתקן את ערך P הנגזר מה-FET. (ג) ניתוח GO של חלבונים מודולריים. התהליכים הביולוגיים הקשורים הכי קרובים מוצגים עבור כל מודול או קבוצת מודול קשורה. אוליגו, אוליגודנדרוציט.
סט של חמישה מודולים עשירים באסטרוציטים ומיקרוגליות (M30, M29, M18, M24 ו-M5) הראו מתאם חיובי חזק עם נוירופתולוגיה של AD (איור 2B). ניתוח אונטולוגיה מקשר בין מודולי גליה אלה עם צמיחת תאים, התפשטות וחסינות (איור 2C וטבלה S2E). שני מודולים גליאליים נוספים, M8 ו-M22, גם הם בעלי ויסות חזק במחלה. M8 קשור מאוד למסלול הקולטן דמוי Toll, מפל איתות הממלא תפקיד מפתח בתגובה החיסונית המולדת (30). יחד עם זאת, M22 קשור קשר הדוק לשינוי שלאחר התרגום. M2, העשיר באוליגודנדרוציטים, מראה מתאם חיובי חזק עם פתולוגיה של AD וקשר אונטולוגי עם סינתזת נוקלאוזידים ושכפול DNA, מה שמעיד על שגשוג תאים משופר במחלות. בסך הכל, ממצאים אלה תומכים בהעלאת מודולי גליה שצפינו בעבר בפרוטאום רשת AD (13, 17). כיום נמצא כי מודולי גליה רבים הקשורים ל-AD ברשת מראים רמות ביטוי נמוכות יותר במקרי בקרה ו-PD, מה שמדגיש את הספציפיות למחלה שלהם המוגברת ב-AD (איור S2C).
רק ארבעה מודולים בפרוטאום הרשת שלנו (M1, M3, M10 ו-M32) נמצאים בקורלציה שלילית מאוד עם פתולוגיה של AD (P <0.05) (איור 2, B ו-C). גם M1 וגם M3 עשירים בסמנים עצביים. M1 קשור מאוד לאותות סינפטיים, בעוד M3 קשור קשר הדוק לתפקוד המיטוכונדריאלי. אין עדות להעשרת סוג תאים עבור M10 ו-M32. M32 משקף את הקשר בין M3 למטבוליזם של התא, בעוד ש-M10 קשור מאוד לצמיחת תאים ולתפקוד המיקרוטובולי. בהשוואה ל-AD, כל ארבעת המודולים מוגברים בשליטה וב-PD, מה שמעניק להם שינויים AD ספציפיים למחלה (איור S2C). בסך הכל, תוצאות אלה תומכות בירידה בשפע של מודולים עשירים בנוירונים שצפינו בעבר בספירה (13, 17). לסיכום, ניתוח הרשת של הפרוטאום המוח שגילינו יצר מודולים שהשתנו ספציפית ל-AD בהתאמה לממצאים הקודמים שלנו.
AD מאופיין בשלב אסימפטומטי מוקדם (AsymAD), שבו אנשים מציגים הצטברות עמילואיד ללא ירידה קוגניטיבית קלינית (5, 31). שלב אסימפטומטי זה מייצג חלון קריטי לגילוי מוקדם והתערבות. הדגמנו בעבר שימור מודולרי חזק של פרוטום רשת המוח של AsymAD ו-AD על פני מערכי נתונים עצמאיים (13, 17). על מנת להבטיח שרשת המוח שגילינו כעת תואמת את הממצאים הקודמים הללו, ניתחנו את השימור של 44 מודולים במערך הנתונים המשוכפל מ-27 ארגוני DLPFC. ארגונים אלה כוללים מקרי שליטה (n=10), AsymAD (n=8) ו-AD (n=9). דגימות בקרה ו-AD נכללו בניתוח של קבוצת המוח הגילוי שלנו (טבלה S1B), בעוד שמקרים של AsymAD היו ייחודיים רק בקבוצת השכפול. מקרי AsymAD אלה הגיעו גם מבנק המוח של Emory Goizueta ADRC. למרות שהקוגניציה הייתה תקינה בזמן המוות, רמות העמילואיד היו גבוהות באופן חריג (ממוצע CERAD, 2.8 ± 0.5) (טבלה S1B).
ניתוח TMT-MS של 27 רקמות המוח הללו הביא לכימות של 11,244 פרוטאומים. ספירה סופית זו כוללת רק את אותם חלבונים שכומתו בלפחות 50% מהדגימות. מערך הנתונים המשוכפל הזה מכיל 8638 (98.0%) מתוך 8817 החלבונים שזוהו בניתוח המוח שגילינו, ויש לו כמעט 3,000 חלבונים שהשתנו באופן משמעותי בין קבוצת הביקורת ל-AD (P <0.05, לאחר בדיקת ה-t המזווגת של Tukey לניתוח שונות) ( טבלה S2F). בין החלבונים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית אלו, 910 הראו גם שינויים משמעותיים ברמות בין AD ומקרי בקרת פרוטאום במוח (P <0.05, לאחר ANOVA Tukey מבחן t-זוגי). ראוי לציין כי 910 סמנים אלה עקביים מאוד בכיוון השינוי בין פרוטאומים (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (איור S3A). בין החלבונים המוגדלים, החלבונים עם השינויים הכי עקביים בין מערכי הנתונים הם בעיקר חברים במודולי M5 ו-M18 העשירים בגליאלים (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 ו-GFAP). בין החלבונים המופחתים, אלו עם השינויים העקביים ביותר היו חברים כמעט אך ורק במודול M1 (NPTX2, VGF ו-RPH3A) הקשורים לסינפסה. עוד אימתנו את השינויים הקשורים ל-AD של midkine (MDK), CD44, הפרשת חלבון 1 הקשור לקרסול (SFRP1) ו-VGF על ידי סופג מערבי (איור S3B). ניתוח שימור מודול הראה שכ-80% ממודולי החלבון (34/44) בפרוטאום המוח נשמרו באופן משמעותי במערך נתוני השכפול (z-score> 1.96, FDR מתוקן P <0.05) (איור S3C). 14 מהמודולים הללו נשמרו במיוחד בין שני הפרוטאומים (z-score> 10, FDR מתוקן P <1.0 × 10-23). בסך הכל, הגילוי והשכפול של מידת העקביות הגבוהה בביטוי הדיפרנציאלי ובהרכב המודולרי בין הפרוטאום המוח מדגיש את יכולת השחזור של השינויים בחלבוני הקורטקס הקדמי של AD. בנוסף, הוא גם אישר כי ל-AsymAD ולמחלות מתקדמות יותר יש מבנה רשת מוח דומה מאוד.
ניתוח מפורט יותר של הביטוי הדיפרנציאלי במערך הנתונים של שכפול המוח מדגיש את הדרגה המשמעותית של השינויים בחלבון AsymAD, כולל סך של 151 חלבונים שהשתנו באופן משמעותי בין AsymAD לבין הבקרה (P <0.05) (איור S3D). בהתאם לעומס העמילואיד, APP במוח של AsymAD ו-AD עלה באופן משמעותי. MAPT משתנה באופן משמעותי רק ב-AD, מה שעולה בקנה אחד עם רמות מוגברות של סבכים והמתאם הידוע שלו עם ירידה קוגניטיבית (5, 7). המודולים העשירים בגליאלים (M5 ו-M18) משתקפים מאוד בחלבונים המוגברים ב-AsymAD, בעוד שמודול M1 הקשור לנוירונים הוא המייצג ביותר של החלבונים המופחתים ב-AsymAD. רבים מסמני AsymAD אלה מראים שינויים גדולים יותר במחלות סימפטומטיות. בין הסמנים הללו נמצא SMOC1, חלבון גליאלי השייך ל-M18, הקשור לגידולי מוח ולהתפתחות עיניים וגפיים (32). MDK הוא גורם גדילה קושר הפרין הקשור לצמיחת תאים ואנגיוגנזה (33), חבר נוסף של M18. בהשוואה לקבוצת הביקורת, AsymAD גדל באופן משמעותי, ואחריו עלייה גדולה יותר ב-AD. לעומת זאת, החלבון הסינפטי neuropentraxin 2 (NPTX2) הופחת משמעותית במוח AsymAD. NPTX2 היה קשור בעבר לניוון עצבי ויש לו תפקיד מוכר בתיווך סינפסות מעוררות (34). בסך הכל, תוצאות אלו חושפות מגוון של שינויים חלבוניים פרה-קליניים שונים ב-AD, שנראה כי מתקדמים עם חומרת המחלה.
בהתחשב בכך שהשגנו עומק משמעותי של כיסוי חלבון בגילוי הפרוטאום במוח, אנו מנסים להבין בצורה מלאה יותר את החפיפה שלו עם תעתיק AD ברמת הרשת. לכן, השווינו את הפרוטאום המוחי שגילינו עם המודול שיצרנו בעבר ממדידת מיקרו-מערך של 18,204 גנים ברקמות AD (n=308) ובקרה (n=157) DLPFC (13). חוֹפֵף. בסך הכל, זיהינו 20 מודולי RNA שונים, שרבים מהם הדגימו העשרה של סוגי תאים ספציפיים, כולל נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ומיקרוגליה (איור 3A). השינויים המרובים של מודולים אלה ב-AD מוצגים באיור 3B. בהתאם לניתוח חפיפת חלבון-RNA הקודם שלנו באמצעות פרוטאום טרשת נפוצה (כ-3000 חלבונים) העמוק יותר (כ-3000 חלבונים) (13), רוב 44 המודולים ברשת הפרוטאומים במוח שמצאנו נמצאים ברשת התעתיק. אין חפיפה משמעותית. הגילוי והשכפול שלנו של 34 מודולי החלבון שנשמרים מאוד בפרוטאום המוח, רק 14 (~40%) עברו את הבדיקה המדויקת של פישר (FET) הוכיחו שיש להם חפיפה מובהקת סטטיסטית עם התעתיק (איור 3A). תואם לתיקון נזקי DNA (P-M25 ו-P-M19), תרגום חלבונים (P-M7 ו-P-M20), קישור/חבור RNA (P-M16 ו-P-M21) ומיקוד חלבון (P-M13 ו-P- M23) אינו חופף עם מודולים בתעתיק. לכן, למרות שמערך נתוני פרוטאום עמוק יותר משמש בניתוח החפיפה הנוכחי (13), רוב הפרוטום של רשת AD אינו ממופה לרשת התעתיק.
(א) FET היפרגיאומטרי מדגים את ההעשרה של סמנים ספציפיים לסוג תא במודול ה-RNA של התעתיק AD (למעלה) ואת מידת החפיפה בין מודולי ה-RNA (ציר ה-x) והחלבון (ציר ה-y) של מוח AD. (למטה). עוצמת ההצללה האדומה מצביעה על מידת ההעשרה של סוגי התאים בלוח העליון ועל עוצמת החפיפה של המודולים בלוח התחתון. כוכביות מצביעות על מובהקות סטטיסטית (P <0.05). (ב) מידת המתאם בין הגנים האופייניים של כל מודול תעתיק ומצב AD. המודולים משמאל הם בעלי המתאם השלילי ביותר עם AD (כחול), ואלו מימין הם בעלי המתאם החיובי ביותר עם AD (אדום). ערך ה-P המתוקן BH שעבר טרנספורמציה בלוג מציין את מידת המובהקות הסטטיסטית של כל מתאם. (ג) מודולים חופפים משמעותיים עם העשרה מסוג תא משותף. (ד) ניתוח מתאם של השינוי בקפל log2 של החלבון המסומן (ציר x) ו-RNA (ציר y) במודול החופף. מוצג מקדם המתאם של פירסון עם ערך ה-P הרלוונטי. מיקרו, מיקרוגליה; גרמי שמים, אסטרוציטים. CT, שליטה.
רוב מודולי החלבון וה-RNA החופפים חולקים פרופילי העשרה דומים מסוג תאים וכיווני AD שינוי עקביים (איור 3, B ו-C). במילים אחרות, מודול M1 הקשור לסינפסה של פרוטום המוח (PM​1) ממופה לשלושה מודולי RNA הומולוגיים עשירים בנוירונים (R-M1, R-M9 ו-R-M16), שנמצאים ב-AD. שניהם הראו. רמה מופחתת. באופן דומה, מודולי החלבון M5 ו-M18 העשירים בגליאליים חופפים למודולי RNA העשירים באסטרוציטים וסמנים מיקרוגליים (R-M3, R-M7 ו-R-M10) והם מעורבים מאוד במחלות גידול. תכונות מודולריות משותפות אלו בין שני מערכי הנתונים תומכות עוד יותר בהעשרת סוג התא ובשינויים הקשורים למחלה שצפינו בפרוטאום המוח. עם זאת, ראינו הבדלים משמעותיים רבים בין רמות ה-RNA והחלבון של סמנים בודדים במודולים משותפים אלה. ניתוח מתאם של הביטוי הדיפרנציאלי של הפרוטאומיקה וה-transcriptomics של המולקולות בתוך המודולים החופפים הללו (איור 3D) מדגיש את חוסר העקביות הזה. לדוגמה, APP וכמה חלבונים אחרים של מודול גליה (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 ו-SFRP1) הראו עלייה משמעותית בפרוטאום AD, אך כמעט לא היה שינוי בתעתיק AD. שינויים ספציפיים לחלבון אלה עשויים להיות קשורים קשר הדוק לפלאקים עמילואידים (23, 35), המדגישים את הפרוטאום כמקור לשינויים פתולוגיים, וייתכן ששינויים אלה לא יבואו לידי ביטוי בתעתיק.
לאחר ניתוח עצמאי של פרוטואומי המוח וה-CSF שגילינו, ערכנו ניתוח מקיף של שני מערכי הנתונים כדי לזהות סמנים ביולוגיים של AD CSF הקשורים לפתופיזיולוגיה של רשת המוח. ראשית עלינו להגדיר את החפיפה של שני הפרוטאומים. למרות שמקובל על כך ש-CSF משקף שינויים נוירוכימיים במוח ה-AD (4), מידת החפיפה המדויקת בין מוח ה-AD והפרוטאום CSF אינה ברורה. על ידי השוואת מספר מוצרי הגנים המשותפים שהתגלו בשני הפרוטאומים שלנו, מצאנו שכמעט 70% (n = 1936) מהחלבונים שזוהו בנוזל השדרה נכמתו גם במוח (איור 4A). רוב החלבונים החופפים הללו (n=1721) ממופים לאחד מ-44 מודולי ביטוי משותף ממערך הנתונים של המוח הגילוי (איור 4B). כצפוי, ששת מודולי המוח הגדולים ביותר (M1 עד M6) הציגו את כמות החפיפה הגדולה ביותר של CSF. עם זאת, ישנם מודולי מוח קטנים יותר (לדוגמה, M15 ו-M29) המשיגים דרגת חפיפה גבוהה באופן בלתי צפוי, גדול יותר ממודול מוח פי שניים מגודלו. זה מניע אותנו לאמץ שיטה מפורטת יותר, מונעת סטטיסטית לחישוב החפיפה בין המוח לנוזל השדרה.
(A ו-B) החלבונים שזוהו במוח הגילוי ובערכות הנתונים של CSF חופפים. רוב החלבונים החופפים הללו קשורים לאחד מ-44 מודולי הביטוי המשותף של רשת הביטוי המשותף במוח. (ג) גלה את החפיפה בין פרוטום נוזל המוח והפרוטום של רשת המוח. כל שורה של מפת החום מייצגת ניתוח חפיפה נפרד של ה-FET ההיפרגאומטרי. השורה העליונה מתארת ​​את החפיפה (הצללה אפור/שחור) בין מודול המוח לבין פרוטום ה-CSF כולו. השורה השנייה מתארת ​​שהחפיפה בין מודולי המוח לחלבון CSF (מוצל באדום) מווסתת משמעותית ב-AD (P <0.05). השורה השלישית מראה שהחפיפה בין מודולי המוח לחלבון CSF (הצללה כחולה) מווסתת משמעותית ב-AD (P <0.05). השתמש בשיטת BH כדי לתקן את ערך P הנגזר מה-FET. (ד) לוח מודול מתקפל המבוסס על שיוך סוג תא ומונחי GO קשורים. פאנלים אלה מכילים בסך הכל 271 חלבונים הקשורים למוח, שיש להם ביטוי דיפרנציאלי משמעותי בפרוטאום CSF.
באמצעות FETs חד זנב, הערכנו את החשיבות של חפיפת חלבון בין פרוטאום CSF ומודול מוח בודד. הניתוח גילה שלסה"כ ל-14 מודולים מוחיים במערך הנתונים של CSF יש חפיפות מובהקות סטטיסטית (FDR מותאם P <0.05), ומודול נוסף (M18) שהחפיפה שלו קרובה למובהקות (FDR מותאם P = 0.06) (איור 4C) , בשורה העליונה). אנו מעוניינים גם במודולים החופפים מאוד לחלבוני CSF בעלי ביטוי דיפרנציאלי. לכן, יישמנו שני ניתוחי FET נוספים כדי לקבוע איזה מבין (i) חלבון CSF גדל באופן משמעותי ב-AD ו-(ii) חלבון CSF ירד משמעותית ב-AD (P <0.05, בדיקת t מבחן AD/ביקורת) מודולי מוח עם חפיפה משמעותית ביניהם. כפי שמוצג בשורות האמצעיות והתחתונות של איור 4C, ניתוחים נוספים אלה מראים ש-8 מתוך 44 מודולי המוח חופפים באופן משמעותי לחלבון שנוסף ב-AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 ו-M38) . ), בעוד שרק שני מודולים (M6 ו-M15) הראו חפיפה משמעותית עם החלבון המופחת ב-AD CSF. כצפוי, כל 10 המודולים נמצאים ב-15 המודולים עם החפיפה הגבוהה ביותר עם הפרוטאום CSF. לכן, אנו מניחים ש-15 המודולים הללו הם מקורות בעלי תשואה גבוהה של סמנים ביולוגיים של CSF שמקורם במוח AD.
קיפלנו את 15 המודולים החופפים הללו לחמישה לוחות חלבון גדולים בהתבסס על קרבתם בתרשים עץ WGCNA והקשר שלהם עם סוגי תאים ואונטולוגיה של גנים (איור 4D). הפאנל הראשון מכיל מודולים עשירים בסמני נוירון וחלבונים הקשורים לסינפסות (M1 ו-M12). הפאנל הסינפטי מכיל בסך הכל 94 חלבונים, והרמות בפרוטאום CSF השתנו באופן משמעותי, מה שהופך אותו למקור הגדול ביותר של סמני CSF הקשורים למוח מבין חמשת הפאנלים. הקבוצה השנייה (M6 ו-M15) הדגימה את הקשר ההדוק עם סמני תאי אנדותל וגוף כלי הדם, כגון "ריפוי פצעים" (M6) ו"ויסות של תגובה חיסונית הומורלית" (M15). M15 גם קשור מאוד למטבוליזם של ליפופרוטאין, אשר קשור קשר הדוק לאנדותל (36). לוח כלי הדם מכיל 34 סמני CSF הקשורים למוח. הקבוצה השלישית כוללת מודולים (M2 ו-M4) הקשורים באופן משמעותי לסמנים של אוליגודנדרוציטים ולשגשוג תאים. לדוגמה, מונחי האונטולוגיה ברמה העליונה של M2 כוללים "ויסות חיובי של שכפול DNA" ו"תהליך ביו-סינתזה של פורין". בינתיים, אלה של M4 כוללים "התמיינות תאי גלייה" ו"הפרדת כרומוזומים". לוח המיאלינציה מכיל 49 סמני CSF הקשורים למוח.
הקבוצה הרביעית מכילה את מירב המודולים (M30, M29, M18, M24 ו-M5), וכמעט כל המודולים עשירים באופן משמעותי בסמני מיקרוגליה ואסטרוציטים. בדומה ללוח המיאלינציה, הפאנל הרביעי מכיל גם מודולים (M30, M29 ו-M18) הקשורים קשר הדוק לשגשוג תאים. המודולים האחרים בקבוצה זו קשורים מאוד למונחים אימונולוגיים, כגון "תהליך ההשפעה החיסונית" (M5) ו"וויסות התגובה החיסונית" (M24). קבוצת החיסון גליאלית מכילה 42 סמני CSF הקשורים למוח. לבסוף, הפאנל האחרון כולל 52 סמנים הקשורים למוח בארבעת המודולים (M44, M3, M33 ו-M38), שכולם נמצאים על הגוף הקשורים לאגירת אנרגיה ומטבוליזם. הגדול מבין המודולים הללו (M3) קשור קשר הדוק למיטוכונדריה והוא עשיר בסמנים ספציפיים לנוירונים. M38 הוא אחד מחברי המודול הקטנים יותר במטבולום זה וגם מפגין סגוליות נוירונים מתונה.
בסך הכל, חמשת הלוחות הללו משקפים מגוון רחב של סוגי תאים ותפקודים בקליפת ה-AD, ומכילים ביחד 271 סמני CSF הקשורים למוח (טבלה S2G). על מנת להעריך את תקפותן של תוצאות טרשת נפוצה אלו, השתמשנו במבחן הארכת הקרבה (PEA), טכנולוגיה מבוססת נוגדנים אורתוגונליים עם יכולות ריבוי, רגישות וסגוליות גבוהות, וניתחנו מחדש את דגימות נוזל המוח שמצאנו תת-קבוצה של 271 הסמנים הביולוגיים הללו. (n = 36). 36 יעדים אלו מדגימים את השינוי בכפול AD של PEA, אשר קשור קשר הדוק לממצאים מבוססי MS שלנו (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), אשר אימת מאוד את התוצאות של ניתוח MS מקיף שלנו (איור S4) ).
הנושאים הביולוגיים המודגשים על ידי חמש הקבוצות שלנו, מאיתות סינפטי ועד חילוף חומרים אנרגטי, קשורים כולם לפתוגנזה של AD (1-3). לכן, כל 15 המודולים המכילים פאנלים אלה קשורים לפתולוגיה של AD בפרוטאום המוח שגילינו (איור 2B). הבולט ביותר הוא המתאם הפתולוגי החיובי הגבוה בין המודולים הגליאליים שלנו והמתאם הפתולוגי השלילי החזק בין המודולים הנוירונים הגדולים ביותר שלנו (M1 ו-M3). ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי של פרוטום המוח המשוכפל שלנו (איור S3D) מדגיש גם חלבונים גליאליים שמקורם ב-M5 ו-M18. ב-AsymAD ובAD סימפטומטי, החלבון הגליאלי המוגבר ביותר וסינפסות הקשורות ל-M1 החלבון מצטמצם ביותר. תצפיות אלו מצביעות על כך ש-271 סמני הנוזל השדרתי שזיהינו בחמש הקבוצות קשורים לתהליכי מחלה בקליפת ה-AD, כולל אלו המתרחשים בשלבים א-סימפטומטיים מוקדמים.
על מנת לנתח טוב יותר את כיוון השינוי של חלבוני הפאנל במוח ובנוזל עמוד השדרה, שרטטנו את הדברים הבאים עבור כל אחד מ-15 המודולים החופפים: (i) מצאנו את רמת השפע של המודול במערך הנתונים במוח ו-(ii) המודול חלבון ההבדל מתבטא בנוזל השדרה (איור S5). כפי שהוזכר קודם לכן, WGCNA משמש לקביעת שפע המודול או ערך החלבון האופייני במוח (13). מפת הר הגעש משמשת לתיאור הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מודולריים בנוזל השדרה (AD/בקרה). נתונים אלה מראים ששלושה מתוך חמשת הפאנלים מציגים מגמות הבעה שונות במוח ובנוזל עמוד השדרה. שני המודולים של לוח הסינפסה (M1 ו-M12) מראים ירידה ברמת השפע במוח ה-AD, אך חופפים באופן משמעותי לחלבון המוגבר ב-AD CSF (איור S5A). המודולים הקשורים לנוירונים המכילים את המטבולום (M3 ו-M38) הראו דפוסי ביטוי דומים של המוח והנוזל השדרתי שאינם עקביים (איור S5E). לוח כלי הדם הראה גם מגמות ביטוי שונות, אם כי המודולים שלו (M6 ו-M15) גדלו באופן מתון במוח AD וירדו ב-CSF החולה (איור S5B). שני הלוחות הנותרים מכילים רשתות גליה גדולות שהחלבונים שלהן מווסתים באופן עקבי בשני התאים (איור S5, C ו-D).
שימו לב שהטרנדים הללו אינם משותפים לכל הסמנים בלוחות אלו. לדוגמה, הפאנל הסינפטי כולל מספר חלבונים המופחתים באופן משמעותי במוח AD ו-CSF (איור S5A). בין סמני הנוזל השדרתי המווסתים מטה הם NPTX2 ו-VGF של M1, וכרומוגרנין B של M12. עם זאת, למרות חריגים אלה, רוב הסמנים הסינפטים שלנו מוגברים בנוזל עמוד השדרה AD. בסך הכל, ניתוחים אלה הצליחו להבחין במגמות מובהקות סטטיסטית ברמות המוח והנוזל השדרתי בכל אחד מחמשת הפאנלים שלנו. מגמות אלו מדגישות את הקשר המורכב ולעיתים השונה בין ביטוי חלבון המוח וה-CSF בAD.
לאחר מכן, השתמשנו בניתוח שכפול טרשת נפוצה בתפוקה גבוהה (שכפול CSF 1) כדי לצמצם את סט 271 הסמנים הביולוגיים שלנו ליעדים המבטיחים והניתנים לשחזור (איור 5A). עותק CSF 1 מכיל בסך הכל 96 דגימות מ-Emory Goizueta ADRC, כולל בקרה, AsymAD וקבוצת AD (טבלה S1A). מקרים אלו של AD מאופיינים בירידה קוגניטיבית קלה (MoCA ממוצע, 20.0 ± 3.8), ושינויים בסמנים ביולוגיים של AD שאושרו בנוזל השדרה (טבלה S1A). בניגוד לניתוח ה-CSF שמצאנו, שכפול זה מבוצע באמצעות שיטת MS "חד-שוט" יעילה ובעלת תפוקה גבוהה יותר (ללא חלוקה לא מקוונת), כולל פרוטוקול הכנת דגימות פשוט המבטל את הצורך בדלדול חיסוני של דגימות בודדות. . במקום זאת, נעשה שימוש ב"ערוץ שיפור" יחיד מדולדל חיסוני כדי להגביר את האות של חלבונים בשפע פחות (37). למרות שהיא מפחיתה את הכיסוי הכולל של הפרוטאומים, שיטה זו של זריקה בודדת מפחיתה באופן משמעותי את זמן המכונה ומגדילה את מספר הדגימות המסומנות TMT שניתן לנתח בנות קיימא (17, 38). בסך הכל, הניתוח זיהה 6,487 פפטידים, שמופו ל-1,183 פרוטאומים ב-96 מקרים. בדומה לניתוח ה-CSF שמצאנו, רק אותם חלבונים שכומתו בלפחות 50% מהדגימות נכללו בחישובים הבאים, והנתונים נגרסו עבור השפעות הגיל והמין. זה הוביל לכימות הסופי של 792 פרוטאומים, 95% מהם זוהו גם במערך הנתונים של CSF שנמצא.
(א) יעדי חלבון CSF הקשורים למוח מאומתים בקבוצת CSF המשוכפלת הראשונה ונכללו בפאנל הסופי (n = 60). (ב' עד ה') רמות סמן ביולוגי של פאנל (ציוני z מורכבים) נמדדו בארבע קבוצות שכפול CSF. נעשה שימוש במבחני t מצמדים או ANOVA עם התיקון שלאחר התיקון של Tukey כדי להעריך את המובהקות הסטטיסטית של השינויים בשפע בכל ניתוח משוכפל. CT, שליטה.
מכיוון שאנו מעוניינים במיוחד לאמת את 271 מטרות CSF הקשורות למוח שלנו באמצעות ניתוח מקיף, נגביל בדיקה נוספת של הפרוטאום המשוכפל הזה לסמנים אלה. מבין 271 החלבונים הללו, 100 זוהו בשכפול CSF 1. איור S6A מציג את הביטוי הדיפרנציאלי של 100 הסמנים החופפים הללו בין דגימות הבקרה לשכפול AD. היסטונים סינפטיים ומטבוליטים עולים הכי הרבה ב- AD, בעוד שחלבוני כלי דם יורדים הכי הרבה במחלה. רוב 100 הסמנים החופפים (n = 70) שמרו על אותו כיוון של שינוי בשני מערכי הנתונים (איור S6B). 70 סמני CSF הקשורים למוח מאומתים אלה (טבלה S2H) משקפים במידה רבה את מגמות הביטוי של הפאנל שנצפו בעבר, כלומר, הרגולציה כלפי מטה של ​​חלבוני כלי הדם והוויסות העלייה של כל שאר הפאנלים. רק 10 מתוך 70 החלבונים המאומתים הללו הראו שינויים בשפע של AD שסותרו את מגמות הפאנל הללו. על מנת ליצור פאנל המשקף בצורה הטובה ביותר את המגמה הכוללת של המוח ונוזל השדרה, הסרנו את 10 החלבונים הללו מפאנל העניין שאותו אימתנו לבסוף (איור 5A). לכן, הפאנל שלנו כולל בסופו של דבר סך של 60 חלבונים מאומתים בשתי קבוצות של CSF AD עצמאיות באמצעות הכנת דגימות שונות וניתוח פלטפורמת MS. עלילות הביטוי של ציון z של לוחות סופיים אלה בבקרת CSF עותק 1 ובמקרי AD איששו את מגמת הפאנל שנצפתה בקבוצת CSF שמצאנו (איור 5B).
בין 60 החלבונים הללו, ישנן מולקולות ידועות כקשורות ל-AD, כמו אוסטאופונטין (SPP1), שהוא ציטוקין פרו-דלקתי, אשר נקשר ל-AD במחקרים רבים (39-41), ו-GAP43, חלבון סינפטי. זה קשור בבירור לניוון עצבי (42). החלבונים המאומתים ביותר הם סמנים הקשורים למחלות נוירודגנרטיביות אחרות, כגון טרשת צדדית אמיוטרופית (ALS) הקשורה לסופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) ו-Desaccharase הקשור למחלת פרקינסון (PARK7). כמו כן, אימתנו כי לסמנים רבים אחרים, כגון SMOC1 וחלבון הצמדת ממברנה עשירה במוח (BASP1), יש קשרים קודמים מוגבלים לניוון עצבי. ראוי לציין כי בשל השפע הכולל הנמוך שלהם בפרוטאום CSF, קשה לנו להשתמש בשיטת זיהוי זו עם תפוקה גבוהה כדי לזהות באופן אמין MAPT וחלבונים מסוימים אחרים הקשורים ל-AD (לדוגמה, NEFL ו-NRGN ) ( 43, 44).
לאחר מכן בדקנו את 60 סמני לוח העדיפות הללו בשלושה ניתוחים משוכפלים נוספים. ב-CSF Copy 2, השתמשנו ב-TMT-MS יחיד כדי לנתח עוקבה עצמאית של 297 דגימות בקרה ו-AD מ-Emory Goizueta ADRC (17). שכפול CSF 3 כלל ניתוח מחדש של נתוני TMT-MS זמינים מ-120 חולי ביקורת ו-AD מלוזאן, שוויץ (45). זיהינו יותר משני שליש מ-60 סמני העדיפות בכל מערך נתונים. למרות שהמחקר השוויצרי השתמש בפלטפורמות טרשת נפוצה שונות ובשיטות כימות TMT (45, 46), שחזרנו היטב את מגמות הפאנל שלנו בשני ניתוחים חוזרים (איור 5, C ו-D, וטבלאות S2, I ו-J). כדי להעריך את ספציפיות המחלה של הקבוצה שלנו, השתמשנו ב-TMT-MS כדי לנתח את מערך נתוני השכפול הרביעי (שכפול CSF 4), שכלל לא רק מקרי בקרה (n=18) ו-AD (n=17), אלא גם PD ( n = 14)), ALS (n = 18) ודמנציה פרונטומפורלית (FTD) (n = 11) (טבלה S1A). כימתנו בהצלחה כמעט שני שלישים מחלבוני הפאנל בקבוצה זו (38 מתוך 60). תוצאות אלו מדגישות את השינויים הספציפיים ל-AD בכל חמשת לוחות הסמנים הביולוגיים (איור 5E וטבלה S2K). העלייה בקבוצת המטבוליטים הראתה את הספציפיות החזקה ביותר של AD, ואחריה קבוצת המיאלינציה והגליה. במידה פחותה, FTD מראה גם עלייה בין הפאנלים הללו, מה שעשוי לשקף שינויים פוטנציאליים דומים ברשת (17). לעומת זאת, ALS ו-PD הראו כמעט את אותם פרופילי מיאלינציה, גליה ומטבולומים כמו קבוצת הביקורת. בסך הכל, למרות הבדלים בהכנת הדגימות, פלטפורמת MS ושיטות כימות TMT, ניתוחים חוזרים אלה מראים שלסמני הפאנל העדיפות שלנו יש שינויים ספציפיים ל-AD ביותר מ-500 דגימות CSF ייחודיות.
ניוון עצבי AD זכה להכרה רחבה מספר שנים לפני הופעת הסימפטומים הקוגניטיביים, ולכן יש צורך דחוף בסמנים ביולוגיים של AsymAD (5, 31). עם זאת, יותר ויותר עדויות מראות שהביולוגיה של AsymAD רחוקה מלהיות הומוגנית, והאינטראקציה המורכבת של סיכון וחוסן מובילה להבדלים אינדיבידואליים גדולים בהתקדמות המחלה שלאחר מכן (47). למרות ששימשו לזיהוי מקרי AsymAD, הרמות של סמני הליבה של CSF (Aβ1-42, total tau ו-p-tau) לא הוכחו כיכולות לחזות באופן אמין מי יתקדם לדמנציה (4, 7), מה שמצביע על יותר. הכרחי לכלול כלי סמנים ביולוגיים הוליסטיים המבוססים על היבטים מרובים של פיזיולוגיה של המוח כדי לרבד במדויק את הסיכון של אוכלוסייה זו. לכן, ניתחנו לאחר מכן את פאנל הסמנים הביולוגיים שלנו עם תוקף AD באוכלוסיית AsymAD של עותק 1 של CSF. 31 מקרים אלה של AsymAD הראו רמות לא תקינות של סמן ביולוגי ליבה (יחס Aβ1-42/סה"כ tau ELISA, <5.5) וקוגניציה מלאה (ממוצע MoCA, 27.1 ± 2.2) (טבלה S1A). בנוסף, לכל האנשים עם AsymAD יש ציון דמנציה קליני של 0, המצביע על כך שאין עדות לירידה בביצועים הקוגניטיביים או התפקודיים היומי.
תחילה ניתחנו את הרמות של הפאנלים המאומתים בכל 96 שכפולי ה-CSF 1, כולל קבוצת AsymAD. מצאנו שלמספר לוחות בקבוצת AsymAD היו שינויים משמעותיים בשפע דמוי AD, לוח כלי הדם הראה מגמת ירידה ב-AsymAD, בעוד שכל שאר הפאנלים הראו מגמת עלייה (איור 6A). לכן, כל הפאנלים הראו מתאם משמעותי ביותר עם ELISA Aβ1-42 ורמות הטאו הכוללות (איור 6B). לעומת זאת, המתאם בין הקבוצה לציון ה-MoCA גרוע יחסית. אחד הממצאים הבולטים יותר מניתוחים אלה הוא המגוון הגדול של שפע הפאנלים בקבוצת AsymAD. כפי שמוצג באיור 6A, רמת הפאנל של קבוצת AsymAD בדרך כלל חוצה את רמת הפאנל של קבוצת הביקורת וקבוצת ה-AD, ומציגה שונות גבוהה יחסית. כדי להמשיך ולחקור את ההטרוגניות הזו של AsymAD, יישמנו ניתוח רב-ממדי (MDS) על 96 מקרים של שכפול CSF 1. ניתוח MDS מאפשר לדמיין את הדמיון בין מקרים על סמך משתנים מסוימים במערך הנתונים. עבור ניתוח אשכולות זה, אנו משתמשים רק באותם סמני פאנל מאומתים שיש להם שינוי מובהק סטטיסטית (P <0.05, AD/בקרה) ברמת הגילוי והשכפול 1 של CSF (n=29) (טבלה S2L). ניתוח זה הפיק מקבץ מרחבי ברור בין הבקרה שלנו למקרי AD (איור 6C). לעומת זאת, חלק מהמקרים של AsymAD מקובצים בבירור בקבוצת הביקורת, בעוד שאחרים ממוקמים במקרי AD. כדי להמשיך ולחקור את ההטרוגניות הזו של AsymAD, השתמשנו במפת ה-MDS שלנו כדי להגדיר שתי קבוצות של מקרי AsymAD אלה. הקבוצה הראשונה כללה מקרי AsymAD שהתקבצו קרוב יותר לבקרה (n=19), בעוד שהקבוצה השנייה אופיינה במקרי AsymAD עם פרופיל סמן קרוב יותר ל-AD (n=12).
(א) רמת הביטוי (ציון z) של קבוצת סמן הביולוגי של CSF בכל 96 הדגימות בקבוצת שכפול CSF 1, כולל AsymAD. ניתוח השונות עם התיקון לאחר התיקון של Tukey שימש כדי להעריך את המובהקות הסטטיסטית של שינויים בשפע בפאנל. (ב) ניתוח מתאם של רמת שפע חלבון בפאנל (ציון z) עם ציון MoCA ורמת טאו כוללת בדגימות ELISA Aβ1-42 ו-CSF עותק 1. מוצג מקדם המתאם של פירסון עם ערך ה-P הרלוונטי. (ג) ה-MDS של 96 מקרים של עותק CSF 1 התבסס על רמות השפע של 29 סמני פאנל מאומתים, אשר שונו באופן משמעותי הן במערך הנתונים של הגילוי והן ב-CSF עותק 1 [P <0.05 AD/בקרה (CT)]. ניתוח זה שימש לחלוקת קבוצת AsymAD לתת-קבוצות בקרה (n=19) ו-AD (n=12). (ד) עלילת הר הגעש מציגה את הביטוי הדיפרנציאלי של כל חלבוני שכפול CSF 1 עם שינוי פיפול log2 (ציר x) ביחס לערך P הסטטיסטי -log10 בין שתי תת-קבוצות AsymAD. הסמנים הביולוגיים של הפאנל הם צבעוניים. (ה) שכפול CSF 1 רמת השפע של הסמנים הביולוגיים של קבוצת הבחירה מתבטאים באופן דיפרנציאלי בין תת-קבוצות AsymAD. ניתוח השונות של Tukey לאחר התאמה שימש להערכת מובהקות סטטיסטית.
בחנו את ביטוי החלבון הדיפרנציאלי בין מקרי הבקרה הללו למקרי AsymAD דמויי AD (איור 6D וטבלה S2L). מפת הר הגעש שהתקבלה מראה ש-14 סמני פאנל השתנו באופן משמעותי בין שתי הקבוצות. רוב הסמנים הללו הם חברים בסינפסה ובמטבולום. עם זאת, SOD1 ו-Myristoyated alanine-rich protein kinase C substrat (MARCKS), שהם חברים בקבוצות החיסון המיאלין והגליה, בהתאמה, שייכים גם הם לקבוצה זו (איור 6, D ו-E). פאנל כלי הדם תרם גם שני סמנים שהופחתו משמעותית בקבוצת AsymAD דמויית AD, כולל חלבון קושר AE 1 (AEBP1) וחבר משפחה משלים C9. לא היה הבדל מובהק בין תת-קבוצות הביקורת ותת-ה-AsymAD דמויות AD ב-ELISA AB1-42 (P=0.38) ו-p-tau (P=0.28), אבל אכן היה הבדל משמעותי ברמת הטאו הכוללת (P=0.0031) ) (איור S7). ישנם מספר סמני פאנל המצביעים על כך שהשינויים בין שתי תת-קבוצות AsymAD משמעותיים יותר מרמות הטאו הכוללות (לדוגמה, YWHAZ, SOD1 ו-MDH1) (איור 6E). בסך הכל, תוצאות אלו מצביעות על כך שהפאנל המאומת שלנו עשוי להכיל סמנים ביולוגיים שיכולים לתת סוג וריבוד סיכון פוטנציאלי של חולים עם מחלה א-סימפטומטית.
קיים צורך דחוף בכלי סמנים ביולוגיים מבוססי מערכת כדי למדוד ולמקד טוב יותר את הפתופיזיולוגיה השונות מאחורי AD. הכלים הללו צפויים לא רק לשנות את מסגרת האבחון של AD שלנו, אלא גם לקדם אימוץ של אסטרטגיות טיפול יעילות וספציפיות למטופל (1, 2). לשם כך, יישמנו גישת פרוטאומיקה מקיפה ללא משוא פנים על מוח AD ו-CSF כדי לזהות סמנים ביולוגיים מבוססי אינטרנט של CSF המשקפים מגוון רחב של פתופיזיולוגיה מבוססת מוח. הניתוח שלנו יצר חמישה לוחות סמנים ביולוגיים של CSF, אשר (i) משקפים סינפסות, כלי דם, מיאלין, חוסר תפקוד חיסוני ומטבולי; (ii) להפגין יכולת שחזור חזקה בפלטפורמות MS שונות; (iii) הראה שינויים מתקדמים ספציפיים למחלה לאורך השלבים המוקדמים והמאוחרים של AD. בסך הכל, ממצאים אלה מייצגים צעד מבטיח לקראת פיתוח של כלים ביולוגיים מגוונים, אמינים ומוכווני אינטרנט עבור מחקר AD ויישומים קליניים.
התוצאות שלנו מדגימות את הארגון המשומר ביותר של פרוטום רשת המוח של AD ותומכות בשימוש בו כעוגן לפיתוח סמנים ביולוגיים מבוססי מערכת. הניתוח שלנו מראה שלשני מערכי נתונים עצמאיים של TMT-MS המכילים מוחות AD ו-AsymAD יש מודולריות חזקה. ממצאים אלה מרחיבים את עבודתנו הקודמת, ומדגימים את שימור המודולים החזקים של יותר מ-2,000 רקמות מוח ממספר קבוצות עצמאיות בקליפת המוח הקדמית, הקודקודית והזמנית (17). רשת קונצנזוס זו משקפת שינויים שונים הקשורים למחלה שנצפו במחקר הנוכחי, כולל הגידול של מודולים דלקתיים עשירים בגליאל וירידה במודולים עשירים בנוירונים. בדומה למחקר הנוכחי, רשת בקנה מידה גדול זה מציגה גם שינויים מודולריים משמעותיים ב-AsymAD, המראה מגוון של פתופיזיולוגיה פרה-קלינית שונה (17).
עם זאת, במסגרת שמרנית מאוד זו מבוססת מערכת, יש הטרוגניות ביולוגית עדינה יותר, במיוחד בקרב פרטים בשלבים המוקדמים של AD. פאנל הסמנים הביולוגיים שלנו מסוגל לתאר שתי תת-קבוצות ב-AsymAD, המדגימות את הביטוי הדיפרנציאלי המשמעותי של סמני CSF מרובים. הקבוצה שלנו הצליחה להדגיש את ההבדלים הביולוגיים בין שתי תתי הקבוצות הללו, שלא היו ברורים ברמת הסמנים הביולוגיים של AD. בהשוואה לקבוצת הביקורת, יחסי Aβ1-42/סה"כ טאו של יחידי AsymAD אלו היו נמוכים באופן חריג. עם זאת, רק רמות הטאו הכוללות היו שונות באופן משמעותי בין שתי תת-קבוצות ה-AsymAD, בעוד שרמות Aβ1-42 ו-p-tau נותרו דומות יחסית. מכיוון שנראה כי טאו גבוה ב-CSF הוא מנבא טוב יותר לתסמינים קוגניטיביים מאשר רמות Aβ1-42 (7), אנו חושדים כי לשתי העוקבות AsymAD עשויות להיות סיכונים שונים להתקדמות המחלה. בהתחשב בגודל המדגם המצומצם של AsymAD שלנו והיעדר נתונים אורכיים, יש צורך במחקר נוסף כדי להסיק בביטחון את המסקנות הללו. עם זאת, תוצאות אלו מצביעות על כך שפאנל CSF מבוסס-מערכת יכול לשפר את יכולתנו לריבד ביעילות של אנשים בשלב האסימפטומטי של המחלה.
בסך הכל, הממצאים שלנו תומכים בתפקיד של פונקציות ביולוגיות מרובות בפתוגנזה של AD. עם זאת, חילוף חומרים אנרגטי לא מווסת הפך לנושא הבולט של כל חמשת לוחות התיוג המאומתים שלנו. חלבונים מטבוליים, כגון hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) ו-lactate dehydrogenase A (LDHA), הם הסמנים הביולוגיים הסינפטיים המאומתים ביותר, המצביעים על כך שהעלייה ב-AD CSF היא מין בר-שחזור. כלי הדם והגליאלים שלנו מכילים גם כמה סמנים המעורבים בחילוף החומרים של חומרים חמצוניים. ממצאים אלו עולים בקנה אחד עם תפקיד המפתח שתהליכים מטבוליים ממלאים במוח כולו, לא רק כדי לעמוד בדרישת האנרגיה הגבוהה של נוירונים, אלא גם כדי לעמוד בדרישת האנרגיה הגבוהה של אסטרוציטים ותאי גליה אחרים (17, 48). התוצאות שלנו תומכות בעדויות הולכות וגדלות לכך ששינויים בפוטנציאל החיזור והפרעה של מסלולי אנרגיה עשויים להיות הקשר המרכזי בין מספר תהליכי מפתח המעורבים בפתוגנזה של AD, כולל הפרעות במיטוכונדריה, דלקת מתווכת גליה ונזק לכלי דם (49). בנוסף, הסמנים הביולוגיים של נוזל השדרה המטבוליים מכילים מספר רב של חלבונים עשירים באופן דיפרנציאלי בין תת-קבוצות השליטה שלנו ותת-הקבוצות AsymAD דמויות AD, מה שמצביע על כך שהשיבוש של מסלולי האנרגיה והחיזור הללו עשוי להיות קריטי בשלב הפרה-קליני של המחלה.
לטרנדים השונים של פאנל המוח והנוזל השדרתי שצפינו יש גם השלכות ביולוגיות מעניינות. סינפסות ומטבולומים עשירים בנוירונים מראים ירידה ברמות במוח AD ושפע מוגבר בנוזל השדרה. בהתחשב בכך שהנוירונים עשירים במיטוכונדריה מייצרות אנרגיה בסינפסות כדי לספק אנרגיה עבור האותות המיוחדים הרבים שלהם (50), הדמיון בין פרופילי הביטוי של שתי קבוצות הנוירונים הללו צפוי. אובדן הנוירונים והשחול של תאים פגומים יכולים להסביר את המגמות הללו בפאנל המוח וה-CSF במחלה מאוחרת יותר, אך הם לא יכולים להסביר את השינויים המוקדמים בפאנל שאנו רואים (13). אחד ההסברים האפשריים לממצאים אלו במחלה א-סימפטומטית מוקדמת הוא גיזום סינפטי לא תקין. עדויות חדשות במודלים של עכברים מצביעות על כך שפגוציטוזיס סינפטי בתיווך מיקרוגליה עשוי להיות מופעל בצורה חריגה ב- AD ולהוביל לאובדן סינפסה מוקדם במוח (51). חומר סינפטי מושלך זה עלול להצטבר ב-CSF, וזו הסיבה שאנו רואים את העלייה ב-CSF בלוח הנוירונים. גיזום סינפטי בתיווך חיסוני עשוי גם להסביר חלקית את העלייה בחלבוני גליה שאנו רואים במוח ובנוזל השדרה לאורך תהליך המחלה. בנוסף לגיזום סינפטי, חריגות כלליות במסלול האקסוציטי עשויות להוביל גם לביטויים שונים במוח וב-CSF של סמנים עצביים. מספר מחקרים הראו שתכולת האקסוזומים בפתוגנזה של מוח AD השתנה (52). המסלול החוץ-תאי מעורב גם בשגשוג של Aβ (53, 54). ראוי לציין שדיכוי ההפרשה האקסוזומלית עשוי להפחית פתולוגיה דמוית AD במודלים של עכברים טרנסגניים AD (55).
במקביל, החלבון בפאנל כלי הדם הראה עלייה מתונה במוח AD, אך ירד באופן משמעותי ב-CSF. הפרעה בתפקוד מחסום דם-מוח (BBB) ​​יכולה להסביר חלקית את הממצאים הללו. מחקרים בלתי תלויים רבים בבני אדם לאחר המוות הוכיחו התמוטטות BBB בAD (56, 57). מחקרים אלו אישרו פעילויות חריגות שונות סביב שכבה אטומה זו של תאי אנדותל, כולל דליפת נימי מוח והצטברות פרוסקולרית של חלבונים הנישאים בדם (57). זה יכול לספק הסבר פשוט לעלייה בחלבוני כלי הדם במוח, אבל זה לא יכול להסביר באופן מלא את הדלדול של אותם חלבונים בנוזל השדרה. אפשרות אחת היא שמערכת העצבים המרכזית מבודדת באופן פעיל מולקולות אלו כדי לפתור את בעיית הדלקת המוגברת ולחץ חמצוני. הירידה בכמה מחלבוני CSF החמורים ביותר בפאנל זה, במיוחד אלה המעורבים בוויסות ליפופרוטאין, קשורה לעיכוב של רמות מזיקות של דלקת ולתהליך ההגנה העצבי של מיני חמצן תגובתיים. זה נכון לגבי Paroxonase 1 (PON1), אנזים קושר ליפופרוטאין האחראי להפחתת רמות הלחץ החמצוני במחזור הדם (58, 59). Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) הוא עוד סמן מווסת משמעותית של קבוצת כלי הדם. זהו המבשר של טרנספורטר השומנים ביקונין, המעורב גם בדיכוי דלקת והגנה נוירולוגית (60, 61).
למרות השערות מעניינות שונות, חוסר היכולת לזהות ישירות מנגנוני מחלה ביוכימית היא מגבלה ידועה של ניתוח פרוטאומי מונע תגליות. לכן, יש צורך במחקר נוסף כדי להגדיר בביטחון את המנגנונים מאחורי לוחות הסמנים הביולוגיים הללו. על מנת להתקדם לפיתוח ניתוח קליני מבוסס טרשת נפוצה, הכיוון העתידי דורש גם שימוש בשיטות כמותיות ממוקדות לאימות סמנים ביולוגיים בקנה מידה גדול, כגון ניטור תגובה סלקטיבית או מקבילה (62). לאחרונה השתמשנו בניטור תגובה מקבילה (63) כדי לאמת רבים משינויי חלבון CSF המתוארים כאן. מספר יעדי פאנל עדיפות נכמתים בדיוק משמעותי, כולל YWHAZ, ALDOA ו-SMOC1, הממפות ללוחות הסינפסה, חילוף החומרים והדלקת שלנו, בהתאמה (63). רכישת נתונים עצמאית (DIA) ואסטרטגיות אחרות מבוססות MS עשויות להיות שימושיות גם לאימות יעד. באד וחב'. (64) לאחרונה הוכח כי קיימת חפיפה משמעותית בין הסמנים הביולוגיים של AD שזוהו במערך הנתונים של גילוי ה-CSF שלנו לבין מערך הנתונים העצמאי של DIA-MS, המורכב מכמעט 200 דגימות CSF משלוש קבוצות אירופאיות שונות. מחקרים אחרונים אלה תומכים בפוטנציאל של הפאנלים שלנו להפוך לזיהוי אמין מבוסס טרשת נפוצה. זיהוי מסורתי מבוסס נוגדנים ואפטאמר חשוב גם להמשך הפיתוח של סמנים ביולוגיים מרכזיים AD. בשל השפע הנמוך של CSF, קשה יותר לזהות סמנים ביולוגיים אלה באמצעות שיטות טרשת נפוצה בתפוקה גבוהה. NEFL ו-NRGN הן שתי דוגמאות כאלה לסמנים ביולוגיים של CSF בשפע נמוך, אשר ממופים לפאנל בניתוח המקיף שלנו, אך לא ניתן לזהות באופן אמין באמצעות אסטרטגיית MS יחידה שלנו. אסטרטגיות מיקוד המבוססות על נוגדנים מרובים, כגון PEA, עשויות לקדם את הטרנספורמציה הקלינית של סמנים אלו.
בסך הכל, מחקר זה מספק גישת פרוטאומיקה ייחודית לזיהוי ואימות של סמנים ביולוגיים של CSF AD המבוססים על מערכות שונות. אופטימיזציה של לוחות סמנים אלה על פני קבוצות AD נוספות ופלטפורמות טרשת נפוצה עשויה להתגלות כמבטיחה לקדם את הריבוד והטיפול בסיכון ל-AD. מחקרים שמעריכים את רמת האורך של פאנלים אלה לאורך זמן הם גם קריטיים כדי לקבוע איזה שילוב של סמנים מרבד בצורה הטובה ביותר את הסיכון למחלה מוקדמת ושינויים בחומרת המחלה.
מלבד 3 הדגימות שהועתקו על ידי CSF, כל דגימות CSF ששימשו במחקר זה נאספו בחסות Emory ADRC או מוסדות מחקר קרובים. בסך הכל נעשה שימוש בארבע קבוצות של דגימות Emory CSF במחקרי פרוטאומיקה אלה. נמצא כי קבוצת ה-CSF מכילה דגימות מ-20 ביקורת בריאות ו-20 חולי AD. עותק CSF 1 כולל דגימות מ-32 ביקורות בריאות, 31 יחידי AsymAD ו-33 אנשים AD. עותק CSF 2 מכיל 147 פקדים ו-150 דגימות AD. קבוצת שכפול CSF רב-מחלות 4 כללה 18 דגימות ביקורת, 17 לספירה, 19 ALS, 13 PD ו-11 דגימות FTD. על פי ההסכם שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת אמורי, כל משתתפי המחקר של אמורי קיבלו הסכמה מדעת. על פי 2014 המכון הלאומי לשיטות עבודה מומלצות להזדקנות למרכזי אלצהיימר (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), נוזל מוחי נאסף ואוחסן על ידי ניקור מותני. חולי בקרה ו-AsymAD ו-AD קיבלו הערכה קוגניטיבית סטנדרטית ב-Emory Cognitive Neurology Clinic או Goizueta ADRC. דגימות הנוזל השדרתי שלהם נבדקו על ידי INNO-BIA AlzBio3 Luminex עבור ELISA Aβ1-42, total tau ו-p-tau אנליזה (65). ערכי ELISA משמשים כדי לתמוך בסיווג האבחוני של נבדקים בהתבסס על קריטריונים לניתוק סמן ביולוגי של AD (66, 67). נתונים דמוגרפיים ודיאגנוסטיים בסיסיים עבור אבחנות CSF אחרות (FTD, ALS ו-PD) מתקבלים גם מ-Emory ADRC או ממוסדות מחקר קשורים. ניתן למצוא את המטא-נתונים של סיכום המקרים עבור מקרי CSF אלה של Emory בטבלה S1A. המאפיינים של קבוצת שכפול ה-CSF השוויצרית 3 פורסמו בעבר (45).
CSF מצא את המדגם. על מנת להגדיל את עומק הגילוי שלנו של מערך הנתונים של CSF, בוצעה צריכה חיסונית של חלבונים בשפע גבוה לפני הטריפסיניזציה. בקיצור, 130 μl של CSF מ-40 דגימות CSF בודדות ונפח שווה (130 μl) של High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) הונחו בעמודת ספין (Thermo Fisher Scientific, A89868) בחדר טמפרטורה דגירה). לאחר ספינינג במשך 15 דקות, צנטריפוגה את הדגימה ב-1000 גרם למשך 2 דקות. מכשיר מסנן אולטרה צנטריפוגלי 3K (Millipore, UFC500396) שימש לריכוז דגימת הקולחים על ידי צנטריפוגה ב-14,000 גרם למשך 30 דקות. לדלל את כל כרכי הדגימה ל-75 μl עם תמיסת מלח מפוצלת בפוספט. ריכוז החלבון הוערך בשיטת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) לפי פרוטוקול היצרן (Thermo Fisher Scientific). CSF מדולדל חיסוני (60 μl) מכל 40 הדגימות עוכל עם lysyl endopeptidase (LysC) וטריפסין. בקצרה, הדגימה הופחתה ואלקילציה עם 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphin ו-3 μl 0.8 M chloroacetamide ב-90°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן עברה קול באמבט מים למשך 15 דקות. הדגימה דוללה ב-193 μl 8 M urea buffer [8 M urea ו-100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] לריכוז סופי של 6 M urea. LysC (4.5 מיקרוגרם; Wako) משמש לעיכול לילה בטמפרטורת החדר. הדגימה דוללה לאחר מכן ל-1 M אוריאה עם 50 mM אמוניום ביקרבונט (ABC) (68). הוסף כמות שווה (4.5 מיקרוגרם) של טריפסין (פרומגה), ולאחר מכן דגירה על הדגימה במשך 12 שעות. חממו את תמיסת הפפטיד המעוכל לריכוז סופי של 1% חומצה פורמית (FA) ו-0.1% חומצה טריפלואורית (TFA) (66), ולאחר מכן התעלו בעמודה של 50 מ"ג Sep-Pak C18 (Waters) כמתואר לעיל (25) . הפפטיד נחלץ לאחר מכן ב-1 מ"ל של 50% אצטוניטריל (ACN). כדי לתקנן את כימת החלבון על פני אצווה (25), מנות 100 μl מכל 40 דגימות ה-CSF שולבו ליצירת דגימה מעורבת, שחולקה לאחר מכן לחמש דגימות סטנדרטיות פנימיות גלובליות (GIS) (48). כל הדגימות הבודדות והתקנים המשולבים מיובשים בוואקום מהיר (Labconco).
CSF מעתיק את המדגם. Dayon ועמיתיו תיארו בעבר דלדול חיסוני ועיכול של CSF עותק 3 דגימות (45, 46). שאר הדגימות המשוכפלות לא נמחקו בנפרד. לעכל דגימות אלה שלא הוסרו בטריפסין כפי שתואר קודם לכן (17). עבור כל ניתוח חוזר, מנות 120 μl של הפפטיד שנפלט מכל דגימה אספו יחד וחולקו למנות בנפח שווה שישמשו כתקן הפנימי הגלובלי שכותרתו TMT (48). כל הדגימות הבודדות והתקנים המשולבים מיובשים על ידי ואקום במהירות גבוהה (Labconco). על מנת לשפר את האות של חלבון CSF בשפע נמוך, על ידי שילוב של 125 μl מכל דגימה, הוכנה דגימה "משופרת" עבור כל ניתוח משוכפל [כלומר, דגימה ביולוגית המחקה את דגימת המחקר, אך הכמות הזמינה היא הרבה יותר גדול (37, 69)] התמזג לתוך מדגם CSF מעורב (17). הדגימה המעורבת הוסרה לאחר מכן באמצעות 12 מ"ל של High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), מעוכל כמתואר לעיל, ונכלל בתיוג ה-TMT המרובה שלאחר מכן.